湯小朋，陳思佳，張永勇，方熱軍

（1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙410128；2.邵陽縣畜牧水產局，湖南邵陽422100）

表皮生長因子的外源表達及其在仔豬生產上的應用前景

湯小朋1，陳思佳1，張永勇2，方熱軍1

（1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙410128；2.邵陽縣畜牧水產局，湖南邵陽422100）

表皮生長因子（Epidermal growth factor,EGF）是促生長因子家族成員之一，具有提高斷奶仔豬生長性能，促進腸道發(fā)育，提高胃腸道消化酶活性，提高免疫力，降低腹瀉率的功效。但是，EGF高昂的價格限制了其在飼料工業(yè)中的應用。然而，隨著生物技術的發(fā)展，利用基因重組技術外源表達EGF，大幅增加了EGF的產量，降低了EGF的成本，使EGF在仔豬飼料中的應用成為可能。文章主要介紹了利用基因工程菌外源表達EGF及表達產物在豬生產中的應用情況，為EGF在仔豬飼糧中的應用提供參考。

表皮生長因子；仔豬；基因工程；外源表達

斷奶應激是仔豬生產中不可避免的現(xiàn)象，可導致仔豬采食量下降，日增重降低，嚴重者導致仔豬腹瀉，甚至死亡，給養(yǎng)豬生產帶來了重大的經濟損失[1]。生產上，通常通過在仔豬飼料中添加抗生素來緩解仔豬斷奶應激，促進仔豬采食與生長，降低仔豬腹瀉的發(fā)生[2]。但是，抗生素的大量使用不可避免的帶來了豬肉抗生素殘留與微生物耐藥性問題，直接或間接危害人的健康[3]。因此，尋求無污染、無殘留的綠色環(huán)保型抗生素替代品的研究已成為整個飼料、養(yǎng)殖行業(yè)的研究熱點。表皮生長因子（Epidermal growth factor,EGF）是一種重要的生長因子，廣泛存在于乳液、唾液、尿液、腸液、血液、羊水等體液中[4]。EGF對早期斷奶哺乳動物的生長、腸道發(fā)育及修復、營養(yǎng)物質轉運等具有促進作用，是一種良好的生長促進劑，可有效減少抗生素的使用[5-8]。隨著生物技術的迅猛發(fā)展，利用基因工程菌外源表達EGF[9-11]，大幅降低了EGF的生產成本，使其在飼料工業(yè)中的應用成為可能。

1 EGF的特性

EGF是Stanley Cohen在1962年從小鼠下頜腺中分離提純出的一種單鏈多肽類活性物質[12]，分子量為6 kDa，含有53個氨基酸殘基，分子內含有3個二硫鍵[4]，其活性中心位于第48～53個氨基酸殘基之間，說明第3個二硫鍵的存在對EGF生物活性的發(fā)揮起重要作用[13]。EGF特殊的結構使其對熱和酸具有較強耐受性，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶及胃蛋白酶的消化[4，13]。Shen等[14]研究了EGF在3日齡哺乳仔豬與45日齡斷奶仔豬胃腸液中的穩(wěn)定性，結果表明，EGF在哺乳仔豬與斷奶仔豬的胃液中降解率低于20%；EGF在3日齡哺乳仔豬的小腸前、中、后段腸液中降解率分別為5%、20%、50%，在45日齡斷奶仔豬的小腸前、中、后段腸液中降解率分別為33%、51%、56%。Shen等[15]研究表明，幼齡仔豬口服EGF后，在腸道仍保留其生物學活性，在胃和小腸前段與EGF受體結合能力仍保持較高水平，只是在小腸后段明顯下降，說明EGF在仔豬腸道中還能發(fā)揮生物學功能。EGF的這些特性使其作為飼料添加劑應用在斷奶仔豬飼料中成為可能。

2 EGF的外源表達

豬乳中EGF含量豐富，是新生仔豬獲取EGF的主要來源。斷奶后，仔豬EGF來源中斷，對其尚未發(fā)育完善的胃腸道來說無疑是雪上加霜。有研究者在斷奶仔豬飼料中添加外源EGF，發(fā)現(xiàn)仔豬腸道發(fā)育明顯好于未添加EGF的仔豬[16-17]。但是，EGF的價格昂貴，作為飼料添加劑成本太高，限制了其在仔豬飼料中的應用。隨著現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展，利用基因工程、蛋白質工程、細胞工程、發(fā)酵工程等技術生產的蛋白質、抗菌肽、酶制劑、激素、疫苗等已廣泛應用于畜牧業(yè)中[18-19]。利用DNA重組技術，將豬EGF基因插入適宜載體，拼接后轉入新的宿主菌中，構建能高效表達EGF的工程菌，是目前提高EGF的產量、降低EGF生產成本的主要途徑。目前，外源表達EGF主要有原核表達系統(tǒng)及真核表達系統(tǒng)。

常用于表達EGF的原核微生物有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及乳酸菌。大腸桿菌是第一個作為宿主菌表達外源基因的微生物，是最經典的原核表達系統(tǒng)，其遺傳背景清楚，操作簡便，生長繁殖速度快，可快速大規(guī)模地生產目的蛋白[20]。Liu等[21]、Abdull等[22]利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功地表達出了人EGF。王雪敏等[23]利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功地表達出了犬EGF。賀超等[24]利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功地表達了豬源EGF。但是，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有其局限性，如不能產生N-和O-端糖基化、脂肪酸酰化、磷酸化及二硫鍵的形成等翻譯后修飾，且表達后目的蛋白的穩(wěn)定性較差。更重要的是大腸桿菌對仔豬來說是致病菌，如果采用大腸桿菌表達，目的蛋白EGF需要分離提純后才能使用，這無形中增加了生產成本?？莶菅挎邨U菌表達系統(tǒng)也是一種常見的原核表達系統(tǒng)，它具有遺傳特性強，分泌蛋白能力強的特點，可以表達原核、真核蛋白?？莶菅挎邨U菌還有一個優(yōu)點，它的細胞壁內不產生脂多糖，發(fā)酵后的產物可以不經過提純，與培養(yǎng)基一起凍干后作為飼料添加劑使用。張博學[10]利用枯草芽孢桿菌和短短芽孢桿菌均成功表達出人EGF。乳酸菌也可作為宿主菌表達外源EGF。Kang等[25]、Wang等[26]利用乳酸乳球菌成功表達豬源EGF。鐘澤民等[11]利用植物乳桿菌表達出了豬EGF。乳酸菌對豬來說是益生菌，仔豬采食一定量的乳酸菌對維持其腸道微生物區(qū)系的平衡具有重要作用。

酵母表達系統(tǒng)具有一定蛋白質翻譯后加工能力，有利于真核蛋白的表達。常用于表達EGF的真核表達系統(tǒng)主要有畢赤酵母表達系統(tǒng)和釀酒酵母表達系統(tǒng)。釀酒酵母是一種單細胞真核微生物，最早應用于酵母基因的克隆和表達。目前，王蜀金等[9]已成功在釀酒酵母中表達出豬EGF，經鑒定表達產物具有生物活性。畢赤酵母表達系統(tǒng)是工業(yè)生產中應用最廣泛，技術最成熟的酵母表達系統(tǒng)。Lee等[27]、汪洋等[28]、廖小金等[29]、Khan等[30]先后利用畢赤酵母成功表達出了EGF。酵母表達外源EGF的效率遠高于大腸桿菌等原核微生物表達EGF的效率（表1）。重組EGF在釀酒酵母、畢赤酵母、乳酸乳球菌及植物乳桿菌等微生物中的成功表達，降低了EGF的生產成本，為其進一步應用于飼料工業(yè)奠定基礎。

表1 重組EGF在不同工程菌中的表達情況

3 EGF表達產物在仔豬生產中的應用

EGF的外源表達大幅提高了EGF的產量，降低了生產成本，使EGF飼料添加劑產品的開發(fā)成為可能。研究表明，給斷奶仔豬額外補充EGF可提高仔豬的采食量，提高日增重，降低腹瀉率，促進腸道發(fā)育，促進腸道消化酶分泌。范志勇等[34]采用腹部皮下注射給予早期斷奶仔豬外源EGF，注射劑量為每天6 μg/kg體重時可顯著改善斷奶仔豬生長性能，減輕斷奶應激。Lee等[27]采用畢赤酵母表達豬EGF，最終得到870 mg/L的表達產物，然后在飼料中添加1.5 mg/kg EGF，飼喂14日齡斷奶仔豬，結果顯著提高了斷奶后1周（0～7 d）的平均日增重，有提高0～14 d平均日采食量、日增重和降低料重比的趨勢，但對0～28 d全期生長性能無顯著影響。李垚等[35]對21日齡斷奶仔豬飼喂EGF，結果發(fā)現(xiàn)仔豬消化道中淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、蔗糖酶和鳥氨酸脫羧酶活性均有提高。EGF還能促進鈉離子、氯離子、鎂離子、無機磷、葡萄糖、谷氨酰胺、小肽、5-羥色胺等物質的吸收轉運[36]。目前應用在仔豬上的主要是乳酸菌及酵母表達的EGF產物，主要應用實例見表2。

表2 外源表達EGF在仔豬上的應用實例

4 小結

EGF可提高斷奶仔豬生長性能、促進腸道發(fā)育和營養(yǎng)物質轉運、提高胃腸道消化酶活性和免疫力及降低腹瀉率。生物技術尤其是基因重組表達技術的發(fā)展為EGF大量生產提供了技術支撐，大幅降低了EGF的生產成本，為EGF在斷奶仔豬上的應用提供了可能，因此EGF作為一種促生長劑在抗生素嚴格控制的現(xiàn)狀下在仔豬生產上將具有廣闊的前景。

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（編輯：郭玉翠）

練瑜伽和普拉提可緩解壓力

【英國《每日電訊報》網(wǎng)站8月15日報道】最新研究顯示，瑜伽和普拉提或具有抗壓效果，因其動作可鎮(zhèn)靜大腦中與“戰(zhàn)斗或逃跑”反應相關的部分。

美國匹茲堡大學的科學家發(fā)現(xiàn)了一個連接大腦和腎上腺髓質的神經回路。腎上腺髓質是腎上腺中心部位組織。當面臨壓力時，該組織會使腎上腺素分泌量增加。

研究發(fā)現(xiàn)，同樣的回路也連接著大腦中掌控動作的運動皮層?？茖W家認為，對協(xié)調性、柔韌性和良好骨骼結構有要求的運動項目或可抑制人體的“戰(zhàn)斗或逃跑”反應。

文章第一作者，匹茲堡大學神經生物學系主任彼德·斯特里克說：“研究結果比我們開始這項研究前所預想的要復雜和有趣得多。”

在實驗中，科學家通過對在互相連接的神經元間游走的病毒進行追蹤來探索連接大腦皮質和腎上腺髓質的神經回路。

當科學家開始探索這個連接大腦和腎上腺髓質的神經回路時，他們驚異于所發(fā)現(xiàn)的神經網(wǎng)絡數(shù)量。

壓力會給人體帶來各種影響，例如心跳加速、出汗以及瞳孔放大，同時還會激發(fā)認知力，讓人們對周遭環(huán)境作出快速評估。

“如果有人欺負了你，你不必揮拳相向，也不必驚慌逃跑，”斯特里克說，“你的反應可能會更加微妙，或是不理不睬，或是作出機智反擊。這些選項都要拜大腦皮層所賜?！?/p>

不過令研究人員驚訝的是，這個神經網(wǎng)絡還連接著原始運動皮層中掌管人體運動和姿勢的部分。

該研究還顯示，當人們預見到沖突或者意識到自己犯錯時，大腦皮層被激活的區(qū)域是腎上腺髓質受到影響的源頭。

斯特里克說：“這說明有一種可能，即當你回想起自己所犯的錯誤、因為某個錯誤而想抽自己、或是想起一件傷心事時，大腦這部分皮層區(qū)域的活動與遭遇真實事件時的反應一樣，會抑制影響腎上腺髓質的信號。”

這些發(fā)現(xiàn)還表明，壓力、沮喪和其他心理狀態(tài)也可以改變器官功能，這說明受心理因素影響的疾病的確有解剖學依據(jù)。

（轉自參考消息[N]，2016-08-17）

The Expression of Epidermal Growth Factor in Recombinant Strains and its Application in Piglets

TANG Xiaopeng1,CHEN Sijia1,ZHANG Yongyong2,FANG Rejun1
(1.College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Animal Husbandry and Fishery Bureau of Shaoyang County,Shaoyang 422100,China)

Epidermal growth factor(EGF)is one of the members of growth factor family,which has trophic effects in the growth performance and the gastrointestinal tract including enhanced proliferation and differentiation. Also,it can improve the activity of gastrointestinal digestive enzymes,enhance immune function and reduce the rate of diarrhea.But,the application of EGF in feed industry was limited due to the high prices of EGF.However,with the development of biotechnology,the production of EGF was increased,and the price of EGF was reduced greatly when the EGF was expressed in recombination strains,which made it a possible used in piglets. This review mainly introduced the situation of EGF expressed in recombinant strains and its application in piglets,and provided a better understanding of the utilization of EGF on piglets feed.

Epidermal growth factor;piglets;genetic engineering;exogenous expression

S816.7

A

1002-1957(2016)05-0029-04

2016-08-15

國家自然科學基金面上項目（31572419）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2016 B276）

湯小朋（1986-），男，湖南邵陽人，在讀博士研究生，主要從事動物營養(yǎng)與飼料研究工作.E-mail：tangxiaopeng110@126.com

方熱軍，教授，博士生導師.E-mail：fangrj63@126.com