蔡擴軍，李愛巧，何生，楊啟元，徐敏，楊小亮，王濤

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊830063；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，烏魯木齊831400）

豬圓環(huán)病毒2型烏魯木齊分離株全基因序列遺傳變異分析

蔡擴軍1，李愛巧1，何生2，楊啟元1，徐敏1，楊小亮1，王濤1

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊830063；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，烏魯木齊831400）

為分析烏魯木齊市豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）遺傳變異情況，對疑似感染PCV2組織樣品的全基因組進行PCR擴增、克隆和測序，并進行序列比對與遺傳進化分析。結果表明，測序的5株PCV2基因組3株全長為1 766 bp，2株全長為1 767 bp，5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之間，與GenBank國內(nèi)外已發(fā)表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%～99.7%之間；遺傳進化樹顯示，3株屬于新出現(xiàn)的PCV2d亞型毒株，2株屬于國內(nèi)優(yōu)勢流行的PCV2b亞型毒株。

豬圓環(huán)病毒2型；遺傳變異；分析

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起的豬的一種傳染病，可引起一系列相關的臨診病癥，其中包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙等，還可能與增生性腸炎、壞死性間質性肺炎、仔豬先天性震顫等有關[1]。其臨床表現(xiàn)多種多樣，主要特征為體質下降、消瘦、貧血、黃疸、生長發(fā)育不良、腹瀉、呼吸困難、母豬繁殖障礙、內(nèi)臟器官及皮膚的廣泛病理變化，特別是腎臟、脾臟及全身淋巴結的高度腫大、出血和壞死。PCV2主要侵害機體的免疫系統(tǒng)，該病可導致豬群產(chǎn)生嚴重的免疫抑制，從而容易繼發(fā)或并發(fā)其他疾病[2]。自1997年加拿大首次報道以來，該病已遍及世界各養(yǎng)豬國家和地區(qū)[3]。我國于1999年首次發(fā)現(xiàn)，目前該病已在我國豬群中廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失，并引起了高度關注[4-5]。

PCV2為圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬成員，病毒粒子為二十面體對稱結構，含有單股負鏈環(huán)狀DNA，基因組全長為1 767 bp或1 768 bp，含有11個閱讀框[6-7]。而近年來不斷有PVC2基因組為1 766 bp新毒株的文獻報道[7-8]，該病毒的基因組不斷地發(fā)生變異，造成的危害日益嚴重[9]。鑒于此，本文通過對烏魯木齊市PCV2流行毒株的全基因組序列進行測序，并跟國內(nèi)外代表毒株進行比對分析，對流行毒株的變異規(guī)律和分子流行病學特征進行探究和分析，以期為本地區(qū)PCV2防治提供必要的分子流行病學信息。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2016年3月15日至4月20日在新疆烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心進行。

1.2 病料樣品

疑似感染PCV2豬的肺臟、淋巴結、扁桃體等組織病料。

1.3 主要試劑

病毒核酸純化試劑盒、Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）購自TaKaRa公司。

1.4 引物設計

上游引物：5'-CCCGTTGGAATGGTACTCCTCAA CTG-3'；下游引物：5'-CGGGGTCTGATTGCTGGTAA TCAGAAT-3'。預計擴增目的片段大小1766~1768bp。

1.5 全基因組的擴增與測序

按照病毒核酸純化試劑盒說明書提取PCV2陽性樣品的DNA。按照Premix Taq說明書對提取的DNA進行PCR擴增，反應體系50 μL：Premix Taq 25 μL；上下游Primer（25 μmol/L）各1 μL；Template DNA 2 μL；RNase Free ddH2O添加至50 μL。反應程序為：94℃30 s、56℃30 s、72℃2 min，32個循環(huán)；72℃10 min，取10 μL PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，并選擇符合目的條帶大小、條帶單一且明亮的PCR陽性產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.6 基因序列遺傳進化分析

應用生物學分析軟件GenBank Blast和DNAStar對擴增的核苷酸序列與GenBank中登錄的PCV2全基因序列進行同源性比較，利用Mega 5.0軟件，NJ法構建系統(tǒng)進化樹（boot strap值為1 000循環(huán)）。

2 結果

2.1 目的基因的擴增結果

用RT-PCR法從9份疑似感染PCV2的樣品中擴增出7份與預期片段大小相符的特異性片段，2份可疑樣品，擴增結果見圖1。

圖1 PCV2全基因PCR擴增電泳結果

2.2 目的基因的序列測定結果

送出測序的5株PCV2樣品3株基因組全長1 766 bp，2株1 767 bp，登錄NCBI利用Blast對測序結果進行分析，結果表明，擴增得到的5條序列為PCV2基因序列，分別命名為WLMQ-1株（1 766 bp）、WLMQ-2株（1 767 bp）、WLMQ-3株（1 767 bp）、WLMQ-4株（1 766 bp）、WLMQ-5株（1 766 bp）。

2.3 PCV2全基因組核苷酸同源性對比分析

5株PCV2全基因組核苷酸序列之間的同源性為96.1%～99.5%；與1010 PCV2a Canada、DBNSX07、DK1980 PCV-2cDenmark、PCV2 LG、PCV2 WuHan、PCV2-09CQ、PCV2-09HeN、PCV2-09HLJ、PCV2-HB、PCV2-QD、PCV2-SC、PCV2-SD、PCV2-SH、PCV2-SHZ、PCV2-SZ、PCV2b France、TJ PCV2d毒株核苷酸序列同源性分別為95.3%～96.2%、96.0%～99.5%、94.7%～95.4%、95.5%～95.8%、95.5%～95.8%、96.2%～99.7%、96.5%～98.8%、95.8%～99.4%、96.2%～99.2%、95.9%～99.5%、94.5%～95.5%、96.3%～98.0%、95.8%～99.4%、95.9%～99.5%、95.1%～95.8%、96.2%～99.7%、96.8%～98.4%。具體比對結果見圖2。

圖2 PCV2分離株全基因組核苷酸同源性比較

2.4 PCV2全基因序列遺傳進化關系

將5株PCV2全基因序列與國內(nèi)外已登錄的17株PCV2全基因序列構建遺傳進化樹（圖3），結果顯示，WLMQ-1、WLMQ-5分離株與PCV2-09CQ、 PCV2-SHZ、TJ PCV2d同屬于PCV2d亞型；WLMQ-2、WLMQ-3與PCV2b France、DBN-SX07同屬于PCV2b亞型；5株分離株與PCV2a亞型親緣關系較遠，與PCV2c亞型親緣關系最遠。

圖3 PCV2全基因序列遺傳進化關系

3 討論

PCV是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒[10]。目前已知的PCV有2個血清型，即PCV1和PCV2[11]。PCV1沒有致病性，PCV2具有致病性。PCV2全基因組存在1 767 bp或1 768 bp兩種不同的長度。本研究測序的5株毒株中3株序列長度為1 766 bp，屬于變異毒株，提示該地區(qū)PCV2在分子水平上已經(jīng)出現(xiàn)了的變異。這也在分子水平上闡明了在烏魯木齊地區(qū)PCV2流行毒株的復雜性和多樣性，而導致這一現(xiàn)象的原因可能與近年來新疆大力發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)而從不同地區(qū)引進了隱性感染PCV2的種豬有一定關系。

最新的研究結果把PCV2分為了PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e等5種基因型亞群[12-13]，國內(nèi)外PCV2分子流行病學的分析結果表明，PCV2基因型發(fā)生了由PCV2a到PCV2b的轉換，我國PCV2存在的基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2d，以PCV2b流行毒株為主，是造成PCV2流行的主要病因[7，14]。全基因組核苷酸同源性比較發(fā)現(xiàn)，5株烏魯木齊PCV2分離株核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之間，與國內(nèi)外已發(fā)表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性也在94.5%～99.7%之間。從本次遺傳進化樹可以看出，烏魯木齊地區(qū)的PCV2基因型3株為PCV2d亞型，2株為PCV2b亞型，據(jù)此推測烏魯木齊地區(qū)PCV2的流行株情況可能與全國流行情況存在一定差異，PCV2d亞型可能逐步成為該地區(qū)PCV2流行毒株的優(yōu)勢基因型，這給本地區(qū)PCV2感染的防控帶來了難度，應引起足夠的重視。另外，遺傳進化分析結果顯示，烏魯木齊地區(qū)正在使用的疫苗株DBN-SX07屬于PVC2b亞型，只與5株病毒中的2株處在同一分支上，說明目前使用的疫苗可能與流行的毒株不是最佳匹配，其疫苗效果可能不是十分理想，需尋求更加合適的疫苗。

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（編輯：富春妮）

S858.282.65+9.2

A

1002-1957(2016)05-0097-03

2016-08-04

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳科技援疆項目（201491165）；烏魯木齊市科技局應用開發(fā)研究計劃（Y141210013）

蔡擴軍（1985-），男，河南虞城人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病診療工作.E-mail:caikuojun@163.com

李愛巧（1966-），女，農(nóng)業(yè)技術推廣研究員，主要從事動物疫病防控工作.E-mail:laq4616369@126.com