撒云俐，那冬晨

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000)

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山楂PCR-SSCP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化

撒云俐，那冬晨*

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000)

[目的]優(yōu)化山楂PCR-SSCP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。[方法]以山楂為材料，采用改良的CTAB法分步提取葉綠體DNA和核DNA，對(duì)PCR-SSCP引物進(jìn)行篩選，同時(shí)進(jìn)行PCR-SSCP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)變性后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。[結(jié)果] ropB、ropL、rpoC1、ITS2、psbA-trnH 5對(duì)引物適用于山楂PCR-SSCP分析。電泳時(shí)，采用6%聚丙烯酰胺凝膠(交聯(lián)度29∶1)，4 ℃恒溫，200 V恒壓，上樣緩沖液(不含甘油)與PCR產(chǎn)物等量混合，98 ℃堿(1%NaOH)變性15 min，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳3～4 h可得到較好的山楂PCR-SSCP電泳圖譜。[結(jié)論]建立了山楂PCR-SSCP最優(yōu)反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，為山楂SSCP分析奠定基礎(chǔ)。

山楂；PCR-SSCP；引物；反應(yīng)體系；反應(yīng)條件

山楂(Crataegusspp.)隸屬于薔薇科(Rosaceae)蘋(píng)果亞科山楂屬，廣泛分布于亞洲、歐洲、中北美洲及南美洲北部，是薔薇科的一種重要植物，也是起源于我國(guó)的特產(chǎn)果樹(shù)[1]。目前對(duì)山楂的研究主要集中在化學(xué)成分分析、藥理、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、育種和遺傳多樣性研究等方面。用于山楂果樹(shù)研究的分子標(biāo)記技術(shù)主要有同工酶技術(shù)、RAPD、ISSR、SSR、PCR-RFLP等[2-3]。山楂種質(zhì)資源的研究仍以傳統(tǒng)分類法為主，已無(wú)法滿足對(duì)山楂種質(zhì)創(chuàng)新和產(chǎn)品更新的需求[4]。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，從分子水平上探討山楂種質(zhì)資源分類，為山楂種質(zhì)資源保存、評(píng)價(jià)和鑒定提供依據(jù)[2]。

SSCP(Single Strand Conformation Ploymorphism)技術(shù)即DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)，基本原理是DNA分子中單個(gè)堿基的變化，可造成DNA單鏈構(gòu)象的巨大變化。DNA片段變性后產(chǎn)生sDNA，sDNA由于分子內(nèi)氫鍵等非共價(jià)鍵的作用，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終形成單鏈構(gòu)象。相同長(zhǎng)度不同構(gòu)象sDNA的電泳速率不同，電泳后在凝膠中停留的位置不同，從而將在雙鏈水平無(wú)法檢測(cè)的DNA微小差異在單鏈水平上檢測(cè)出來(lái)[5]。SSCP技術(shù)是隨著對(duì)人類基因組的研究而發(fā)展起來(lái)的用于檢測(cè)堿基突變的技術(shù)，同時(shí)也是分子遺傳標(biāo)記中最常用的方法之一[6]。

近年來(lái)，SSCP技術(shù)不斷發(fā)展和完善，與PCR技術(shù)相結(jié)合建立的PCR-SSCP技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、需要樣品少和適于大樣本篩選等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各種領(lǐng)域，為開(kāi)展群體遺傳分析、基因分型、檢測(cè)由基因突變引起的各種遺傳病等研究提供了有力工具[6-7]。但仍存在一些缺陷，如對(duì)大于300 bp的DNA片段，隨著DNA片段長(zhǎng)度的增加，檢測(cè)的敏感性逐漸降低[6]。同時(shí)，SSCP技術(shù)也易受上樣緩沖液、變性時(shí)間及溫度、電泳條件等因素的影響，目前在已有的報(bào)道中，SSCP分析所用的方法和試驗(yàn)條件由于研究對(duì)象的不同而存在較大差別。筆者對(duì)山楂SSCP分析的前期試驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，以期為山楂SSCP分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 山楂幼嫩葉片采于山西師范大學(xué)校園內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取。采用改良的CTAB法進(jìn)行葉綠體DNA和核DNA的分步提取[8-9]，具體步驟：①采摘山楂新鮮幼嫩葉片，洗凈，吸干水分，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量預(yù)冷的0.14 mol/L NaCl溶液，快速充分研磨成漿。②吸取植物漿液1.0 mL放入1.5 mL離心管中。③4 ℃、1 000 r/min離心20 min，取上清液于另一離心管(標(biāo)記為A)中，用于葉綠體DNA的提取。沉淀標(biāo)記為B，用于核DNA的提取。④A管4 ℃、3 000 r/min離心20 min，棄上清。⑤在A、B管沉淀中均加入600 μL預(yù)熱的2%CTAB溶液，迅速混勻，65 ℃水浴20 min。⑥冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇(氯仿∶異戊醇=24∶1)，作用15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清。重復(fù)此步驟2次。⑦加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕柔顛倒混勻，室溫沉淀5 min后，12 000 r/min離心8 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，揮發(fā)乙醇至沉淀透明，用適量滅菌的去離子水溶解沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆?。⑧?.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 引物篩選。選取psbA-trnH、ropB、ropL、rpoC1、ITS2、ACT2p、SOD、I1-5.8-I2作為候選引物，其序列見(jiàn)表1。

表1 候選引物序列

從上述8對(duì)候選引物中分別篩選出適合葉綠體DNA和核DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物，同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化。每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)條件見(jiàn)表3。

表2 PCR-SSCP反應(yīng)體系

表3 PCR-SSCP反應(yīng)條件

1.2.3 電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳(85 V)檢測(cè)，Gene Green核酸染料染色。

1.2.4 SSCP分析。6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制參考鮑思元[10]方法，30%丙烯酰胺15.0 mL、10×TBE 2.5 mL、ddH2O 32.5 mL、10%過(guò)硫酸銨750.0 μL、TEMED 75.0 μL。上樣緩沖液含有1%NaOH，不含甲酰胺，上樣緩沖液量∶PCR產(chǎn)物=1∶1，98 ℃變性15 min后，立即置于冰上，取8 μL上樣，電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳溫度4 ℃，電壓為200 V，電泳完畢后進(jìn)行銀染，并觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂葉綠體DNA序列引物的篩選 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，psbA-trnH、ropB、ropL、rpoC1 4對(duì)引物均可用于山楂PCR-SSCP分析。其中，rpoC1、ropL、ropB 3對(duì)引物擴(kuò)增效果較好，擴(kuò)增率可達(dá)100%，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別約375、600、300 bp(圖1)。psbA-trnH作為引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物具有2條亮帶，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約220 bp，另一亮帶出現(xiàn)的原因可能是引物二聚體(圖2)。

注：M.DL 2000 DNA Marker，CK.對(duì)照，1.rpoC1，2.ropL，3.ropB。Note：M.DL 2000 DNA Marker, CK.control , 1.rpoC1, 2.ropL, 3.ropB.圖1 rpoC1、ropL和ropB引物PCR-SSCP電泳圖譜Fig.1 The PCR-SSCP results of rpoC1，ropL and ropB primers

2.2 山楂核DNA序列引物的篩選 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，ITS2適合作為山楂核DNA的PCR-SSCP分析，擴(kuò)增率達(dá)100%，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為550～600 bp(圖2)。I1-5.8-I2、ACT2p、SOD 3對(duì)引物不適合作為山楂核DNA PCR-SSCP擴(kuò)增。其中，I1-5.8-I2和SOD經(jīng)多次優(yōu)化，尚未得到穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物。ACT2p經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化，均得到多個(gè)非特異性擴(kuò)增條帶。

注：M.DL 2000 DNA Marker,CK.對(duì)照,1.I1-5.8-I2,2.ITS2,3.psbA-trnH。Note：M.DL 2000 DNA Marker,CK.control,1.I1-5.8-I2,2.ITS2,3.psbA-trnH.圖2 ITS2、I1-5.8-I2和psbA-trnH引物PCR-SSCP電泳圖譜Fig.2 The PCR-SSCP results of ITS2，I1-5.8-I2 and psbA-trnH primers

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果，選擇6%的凝膠配比，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用堿變性。恒壓200 V、4 ℃條件下電泳3～4 h。電泳結(jié)束后，蒸餾水沖洗凝膠2～3次，0.2% AgNO3染色液中染色約8 min，再用蒸餾水漂洗2～3次，顯色液(3%NaOH、1.5 mL甲醛)中顯色約20 min，至出現(xiàn)清晰的條帶(圖3)。

注：M.DL 2000 DNA Marker,CK.對(duì)照,1.ropB,2.ropL,3.rpoC1,4.psbA-trnH,5.ITS2。Note：M.DL 2000 DNA Marker,CK.control,1.ropB,2.ropL,3.rpoC1,4.psbA-trnH,5.ITS2。圖3 山楂PCR-SSCP電泳圖譜Fig.3 The PCR-SSCP results of Crataegus spp.

3 結(jié)論與討論

通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)從候選的8對(duì)引物中篩選出5對(duì)適于山楂葉綠體DNA(ropB、ropL、rpoC1、psbA-trnH)和核DNA(ITS2)PCR-SSCP分析的引物。在PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠濃度不能過(guò)高，上樣量不能過(guò)多，否則，電泳圖譜不整齊，條帶拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，以致于在確定片段大小時(shí)，會(huì)造成較大誤差。

該試驗(yàn)對(duì)聚丙烯酰胺凝膠制備時(shí)過(guò)硫酸銨和TEMED的加入量進(jìn)行了反復(fù)試驗(yàn)，參考鮑思元[10]的制膠方法，配制了6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，結(jié)果放置7 h也未能凝固。張俊等[11]認(rèn)為在排除凝膠成分配比錯(cuò)誤的前提下，膠未凝固大多是由于過(guò)硫酸銨溶液存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起的。鮑思元[10]認(rèn)為10%的過(guò)硫酸銨必須現(xiàn)配現(xiàn)用，4 ℃冰箱保存不超過(guò)48 h。根據(jù)查閱的信息，重新配制了過(guò)硫酸銨(10%)，對(duì)凝膠成分配比進(jìn)行了調(diào)整，重新制膠，結(jié)果凝膠時(shí)間不理想，約2 h后才能凝固，且所制的凝膠韌性不好，易碎，對(duì)于電泳后的染色、顯色操作不利。根據(jù)胡建斌等[12]的結(jié)果，該研究加大了10%過(guò)硫酸銨和TEMED的量，50 mL凝膠中，加入1 000 μL 10%過(guò)硫酸銨和100 μL TEMED，發(fā)現(xiàn)膠凝固時(shí)間明顯縮短，但所制的膠凝固不均勻，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終50 mL凝膠加入750 μL 10%過(guò)硫酸銨和75 μL TEMED，約1 h膠即可凝固，且膠的韌性較好，電泳后條帶也較整齊。該試驗(yàn)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性采用堿變性的方法，發(fā)現(xiàn)其效果與余桂紅等[5]采用98%去離子甲酰胺的變性效果相差不大。

該試驗(yàn)并未對(duì)影響山楂SSCP分析的各種因素進(jìn)行逐一研究，僅優(yōu)化了山楂PCR-SSCP的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，最后對(duì)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料并經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定，電泳結(jié)果較好，條帶較清晰。該試驗(yàn)結(jié)果對(duì)以后山楂分子生物學(xué)方面的研究以及聚丙烯酰胺凝膠的制備提供參考。參考文獻(xiàn)

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Optimization of PCR-SSCP Reaction System and Reaction Condition inCrataegusspp.

SA Yun-li, NA Dong-chen*

(Shanxi Normal University School of Life Science, Linfen, Shanxi 041000)

[Objective] The aim was to optimize PCR-SSCP reaction system and reaction condition. [Method] The chloroplast DNA and nuclear DNA inCrataegusspp. were step-by-step extracted by improved CTAB method, the PCR-SSCP primers were selected, and the PCR-SSCP reaction system and reaction conditions were optimizated. The PCR-SSCP productions were tested by agarose gelelectrophoresis, the denatured PCR-SSCP products were analyzed by native polyacrylamide gel. [Result]The results showed that five pairs primers (psbA-trnH、ropB、ropL、rpoC1、ITS2) of all are suitale for PCR-SSCP inCrataegusspp.. The clear electrophoretogram of PCR-SSCP inCrataegusspp. were obtained through using 6% native polyacrylamide gel. (Crosslinking degree is 29∶1) at 4 ℃ and 200 V for 3-4 h, with the volume of the loading buffer (without glycerol) was same with the volume of PCR products, denaturation temperature was 98 ℃ under 1%NaOH, denaturetion time was 15 minutes, electrophoresis buffer was 0.5×TBE.[Conclusion]The study optimize PCR-SSCP reaction system and reaction condition, in order to lay the foundation for optimization of hawthorn SSCP analysis.

Crataegusspp；PCR-SSCP；Primers；Reaction system；Reaction conditions

撒云俐(1994- )，女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。*通訊作者，副教授，碩士，從事遺傳學(xué)方面的研究。

2016-10-21

S 188

A

0517-6611(2016)33-0137-03