?蔣 昊，桂? 茜，阮 穎

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

江永香柚不同發(fā)育時期果皮分泌結(jié)構(gòu)及油體的觀察

蔣 昊，桂? 茜，阮 穎

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

利用冰凍切片法和組織化學(xué)方法對江永香柚不同發(fā)育時期果實(shí)的果皮進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)、分泌組織和油體的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：授粉后發(fā)育至70 d左右的江永香柚果實(shí)，其果皮為綠色，外果皮細(xì)胞內(nèi)含大量葉綠體。發(fā)育70～150 d的果實(shí)其果皮逐漸由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，外果皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體分布逐漸減少。柚果實(shí)外果皮有分泌結(jié)構(gòu)（精油腔）散布在外果皮中，精油腔由兩個腎形細(xì)胞包圍而成，精油腔空隙含有較多的油體。外果皮細(xì)胞內(nèi)有黃色油體的分布，與同屬的橙果實(shí)外果皮中相比，油體體積大，數(shù)量少。

江永香柚；冰凍切片；分泌結(jié)構(gòu)；油體

柚子（Citrus maxima）是蕓香科植物柚的成熟果實(shí)，產(chǎn)于我國南方地區(qū)[1-2]。柚子清香、酸甜、涼潤，營養(yǎng)豐富，藥用價值很高，是人們喜食的水果之一，也是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的最具食療效果的水果[3-4]。柚子茶和柚子皮也都具實(shí)用價值，且可入藥[5]。江永香柚是湖南省江永縣種植的一個柚類水果，屬于蕓香科柚屬，葉型似心臟。常綠喬木，樹形開張，經(jīng)濟(jì)壽命60 a左右?；ù蟀咨麑?shí)形似葫蘆，未成熟時顏色翠綠，成熟后色澤金黃，果底有銅錢般的圓圈印環(huán)，俗稱“金錢花”（圖1），是辨別真假香柚的標(biāo)志。果肉似白玉，厚實(shí)汁多，清香嫩脆， 帶有蜜味。據(jù)測定，內(nèi)含可溶性固形物15.2%，總糖13.86%，總酸0.28%，每100g果汁含維生素C158.1 mg[6-11]。具有降血壓、助消化、止咳化痰、健脾、通便之功能[12]。柚皮可作蜜餞，花、葉可提煉芳香油，柚汁可做成飲料罐頭[13]。柚果可貯藏180 d以上，有“天然罐頭”之美稱。柚香精油是香料工業(yè)級精細(xì)化工的重要的天然原料，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品等行業(yè)。柚香精油有獨(dú)特的芳香，但至今無法化學(xué)合成，也不能用其他柑橘代替[14-17]。柚香精油主要存在于柚的果皮中[18-20]。本研究以香著稱的江永香柚為研究對象，對其不同發(fā)育時期果實(shí)進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)、分泌結(jié)構(gòu)及油體觀察，旨在為充分開發(fā)利用香柚，提高果皮含油量奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料、儀器和試劑

1.1.1材 料 實(shí)驗(yàn)材料為江永香柚果實(shí)，種植于湖南省江永縣。分別選取授粉后發(fā)育至70、80、90、100、110、120、130、140，150 d的柚果實(shí)（編號分別為1-9號）；完全成熟的臍橙備用。

1.1.2儀 器 YD-2508AIII冰凍切片機(jī)，motic普通光學(xué)顯微鏡及附帶數(shù)碼照相機(jī)，數(shù)碼照相機(jī)。

1.1.3試 劑 磷酸緩沖液（1L配方：KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，蔗糖100 g，10% HCHO 400 mL，加去離子水充分?jǐn)嚢枞芙猓尤臌}酸調(diào)pH值至7.0，定容1 L），普通膠水，蘇丹III。

1.2試驗(yàn)方法與步驟

1.2.1樣品預(yù)處理及材料固定 柚果實(shí)、橙果實(shí)采后用蒸餾水沖洗，洗去果皮上的灰塵等異物。選擇果形果色均勻并等位截取新鮮組織方塊（0.5 cm×0.5 cm），將切取的方塊立即置于磷酸緩沖液 （含有10%的蔗糖的 PBS，pH值7.0）的固定液中，經(jīng) 1 h真空處理后，于4 ℃下繼續(xù)固定3～4 h[21]。

1.2.2材料的包埋和切片 用10%的蔗糖磷酸緩沖液浸洗，用普通膠水包裹在小盒（1.0 cm×1.0 cm）內(nèi)，并迅速在液氮中冷凍。經(jīng)冷凍后的包埋塊可直接切片或超低溫保存。恒溫-40℃切片。切片厚度為12～18 μm，切片機(jī)冷刀溫度為-20℃[22-23]。

1.2.3制片和染色 用蒸餾水從載玻片與蓋玻片一側(cè)滴入，用吸水紙從另一側(cè)不斷吸去液體以去除固定液，重復(fù)一次；從載玻片與蓋玻片一側(cè)滴入蘇丹III ，用吸水紙從一側(cè)吸收染色液，使染色液充滿整個裝片，染色15～20 min。

1.2.4顯微觀察 裝片直接放到motic顯微鏡載物臺上，進(jìn)行觀察與拍照[24]。

2　結(jié)果與討論

2.1柚果實(shí)發(fā)育的形態(tài)觀察

不同發(fā)育時期的柚果實(shí)的果實(shí)形態(tài)如圖1所示。對表皮顏色及果皮特征比較觀察結(jié)果顯示，柚果皮分為：外果皮、中果皮、內(nèi)果皮（圖2-3，2-4）。外果皮中含有精油腔，細(xì)胞內(nèi)有大量色素；中果皮和內(nèi)果皮呈白色，海綿質(zhì)。柚果實(shí)授粉后發(fā)育至70 d左右為比較均勻球形（圖1-1），外果皮為黃綠色（圖2-1），表面分布大量的精油腔凸起，長徑為577.89±32.76 μm（圖2-1），截面可見大量精油腔，長徑為475.33.±34.36 μm（圖2-3）；70 d到完全成熟柚果實(shí)形態(tài)接近梨形，外果皮由逐漸變?yōu)樯罹G色（圖2-2），發(fā)育至100 d的外果皮表面大精油腔長徑為831.98±50.06 μm（圖2-2），截面可見大量精油腔，長徑為1.25±0.24 mm（圖2-4）。果實(shí)授粉后發(fā)育至150 d，柚子成熟（圖1-9），其外果皮為金黃色。

2.2不同發(fā)育時期外果皮的特征及精油腔的分布

對不同發(fā)育時期果皮的冰凍切片進(jìn)行顯微觀察顯示：在授粉后100 d的外果皮中，最外1～3層細(xì)胞呈磚形（圖3-2），排列緊密，細(xì)胞內(nèi)無葉綠體的分布，具有復(fù)表皮的結(jié)構(gòu)特征。最外面還覆蓋一層特化的蠟質(zhì)層（圖3-3）。在表層細(xì)胞之內(nèi)是橢圓形的薄壁細(xì)胞區(qū)，細(xì)胞內(nèi)含有大量的葉綠體，有胞間隙（圖3-1）。在外果皮和中果皮過度區(qū)域，薄壁細(xì)胞的體積增大，葉綠體的含量減少。此外，在表層細(xì)胞中，有精油腔的分布，精油腔空隙含有較多的油體，精油腔長徑約為128.22±5.34 μm（圖3-4）。

圖1　柚果實(shí)外部形態(tài)觀察

圖2　柚外果皮結(jié)構(gòu)的體視顯微照片

圖3　授粉后100 d的柚外果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯微照片

在授粉后140 d的外果皮中層，外果皮中部為厚角組織區(qū)，為不規(guī)則多邊形，細(xì)胞排列緊密，胞間隙很小（圖4-1）。細(xì)胞內(nèi)含葉綠體和少量油體。精油腔位于厚角組織區(qū)，由兩個腎形細(xì)胞包圍而成（圖4-1）。精油腔空隙含有較多的油體，精油腔長徑約為150.33±8.29 μm（圖4-2）。

在授粉后150 d的外果皮中層，外果皮中部為厚角組織區(qū)，為不規(guī)則多邊形，細(xì)胞排列緊密，胞間隙很?。▓D5-1）。細(xì)胞內(nèi)不含葉綠體，含有大量黃色的油體，油體體積較大，長徑為60.31±15.17 μm（圖5-1）。精油腔位于厚角組織區(qū)，由兩個腎形細(xì)胞包圍而成，腎形細(xì)胞與薄壁細(xì)胞鄰接面細(xì)胞壁較薄，而靠近精油腔縫隙的壁增厚（圖5-2）。精油腔空隙含有大量的油體，周圍細(xì)胞也含有大量油體，精油腔長徑約為176.19±12.08 μm（圖5-2）。

圖4　授粉后140 d的柚外果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯微照片

圖5　授粉后150 d的柚外果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯微照片

在授粉后150 d的果皮中，精油腔有垂直于外果皮分布（圖6-1），也有與外果皮成一定角度斜立于外果皮上（圖6-1），果皮細(xì)胞中含有大量黃色的油體，但集中在分泌組織周圍細(xì)胞（圖6-3）。精油腔的數(shù)目增多，有些精油腔相距較短，約為1617.57±77.99 μm（圖6-3）。

2.3授粉后150?d橙果實(shí)外果皮的特征及精油腔的分布

在授粉后150 d的橙果實(shí)外果皮中細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，細(xì)胞排列緊密，胞間隙很小（圖7-1）。細(xì)胞內(nèi)不含葉綠體，含有黃色的油體，油體體積較小，數(shù)量較多，油體長徑為24.73±0.99 μm（圖7-1）。精油腔位于厚角組織區(qū)，精油腔空隙含有大量的油體，周圍細(xì)胞也含有大量油體，精油腔長徑約為141.50±9.01 μm（圖7-2）。

圖6　授粉后150 d的柚外果皮精油腔結(jié)構(gòu)的顯微照片

圖7　完全成熟的橙外果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯微照片

3　結(jié) 論

隨著柚子的逐漸成熟，中果皮部位細(xì)胞由橢圓形的薄壁細(xì)胞，逐漸變?yōu)槎噙呅蔚暮窠羌?xì)胞。果皮細(xì)胞中葉綠體逐漸變少，油體則逐漸增多。精油腔由兩個腎形細(xì)胞包圍而成，精油腔空隙含有較多的油體。精油腔的分布于外果皮外層逐漸到外果皮中間部位，數(shù)量也逐漸增多。

授粉后發(fā)育至70 d左右的江永香柚果實(shí)，其果皮為綠色，果皮細(xì)胞內(nèi)含大量葉綠體和少量油體，有精油腔。授粉后70～100 d天的果實(shí)其果皮逐漸由黃綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，100 d左右外果皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體的分布增多，有分泌結(jié)構(gòu)（精油腔）散布在外果皮中。授粉后100～150 d的果實(shí)其果皮逐漸由深綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，150 d左右外果皮細(xì)胞內(nèi)無葉綠體，分布大量油體，較多的分泌結(jié)構(gòu)（精油腔）散布在外果皮中。

與授粉后150 d的橙果實(shí)外果皮相比，授粉后150 d的柚果實(shí)外果皮精油腔數(shù)量較少，體積較大；精油腔結(jié)構(gòu)相似。

[1]陽梅芳.柚子黃酮類物質(zhì)提取、分離及生物特性研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2013.

[2]Habtem S.Flavonoids as inhibitors or enhancers of the cytotoxieity of tumor Necrosisfactor-929 tumor cells [J].JNatprod.1997， 60（8）：775-775.

[3]李睿曉.柚子酒的微生物脫苦技術(shù)研究[D].重慶：西南大學(xué)，2010.

[4]周 殷，胡長偉，李鶴等.柚子皮吸附劑的物化特性研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，（11）：87-91.

[5]吳麗萍，朱 妞，臧 鮑.超聲波輔助蒸餾法提取胡柚皮中香精油的研究[J].黃山學(xué) 院學(xué)報(bào)，2014，（5）：58-61.

[6]肖麗鳳.柚子中組分的提取、分離及分析方法的研究[D].南昌大學(xué)，2007.

[7]張 昭.中國地方柚果實(shí)酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性分析[D].重慶：西南大學(xué)，2015.

[8]任永康.柚果實(shí)黃酮合成相關(guān)基因cDNA克隆及生物信息學(xué)分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2010.

[9]Giamperi L，F(xiàn)raternale D，Bucchini A，et al.Antioxidant activity of Citrus paradisi seeds glyceric extract [J].Fitoterapia，2004，75（2）：221- 224

[10]Gorinstein S，Cvikrova M，Machackova I，et al.Characterization of antioxidant compounds in Jaffa sweeties and white grapefruits [J].Food chem.， 2004，84（4）：503- 510

[11]Gorinstein S，Zachwieja Z，Katrich E，et al.Comparison of the contents of the main antioxidant compounds and the antioxidant activity of white grapefruit and his newhybrid [J].Lebensm.Wiss.u.Technol.2004，37（3）：337- 343

[12]賴金盛，黃育宗.柚子果實(shí)日灼病的發(fā)生及防治[J].福建農(nóng)業(yè)科技，1995，（4）：41.

[13]周成敏，尤根彪，吳家學(xué)等.不同套袋模式對2種柚子果實(shí)品質(zhì)及效益的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，（2）：80-82.

[14]朱岳麟，鄭曉梅，鄒卓等.GC-MS法分析紅肉蜜柚果皮香精油的化學(xué)成分[J].廣東化工，2008，（9）：129-131，55.

[15]Bailey S E，Olin T J，Bricka M，et al.A review of potentially low-cost sorbents for heavy metals[J].Water Research，1999，33：2469-2479.

[16]Morais L C，F(xiàn)reitas O M，Goncalves E P，et al.Reactivedyes removal from wastewaters by adsorption on eucalyptus bark：ocariables that define the process[J].Water Research，1999，33：979-988.

[17]Ferrero F.Dye removal by low cost adsorbents hazelnut shells[J].Journal of Hazardous Materials，2007，142：144-152.

[18]黃桂萍，王青豪，鐘 平.柚樹葉中提取香精油的新方法——微波輻射法的研究[J].江西林業(yè)科技，2007，（1）：34-35，41.

[19]萬揚(yáng)艷.玉環(huán)柚皮主要成分提取工藝及含量研究[D].杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2011.

[20]王 華，吳厚玖，焦必林，等.柚香精油的提取與成分研究[J].中國南方果樹，1999，（6）：13-14.

[21]陳 丹，趙 潔.適合于植物花器官的冰凍切片技術(shù)[J].武漢植物學(xué)研究，2005，03：285-290.

[22]Jetter R，Kunst L，Samuels AL.Composition of plant cuticular waxes.In：Riederer M，Müller C，eds.Biology of the Plant Cuticle[M].Oxford：Blackwell Publishing.2006.182–215.

[23]嚴(yán)明理，劉麗莉，王帥斌等.一種植物組織原花色素顯微觀察的冰凍切片方法[J].植物生理學(xué)報(bào)，2013，（8）：829-831.

[24]李正理，張新英．植物解剖學(xué)[M].北京：高等教育出版社．1983.

（責(zé)任編輯：高國賦）

The?Observe?of?Pericarp?Secretion?and?Observe?Structure?of?Oil?Body?for?Jiangyong?Pomelo?in?Different?Developmental?Stages

JIANG Hao，GUI Xi，RUAN Ying
（Agronomy College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Using frozen sectioning and histochemistry of Jiangyong fragrant shaddock fruit at different developmental stages of pericarp microstructure and observation of the tissue and oil secretion, it was found: development after pollination to about 70 days of Jiangyong fragrant citrus fruit and the peel is green, the exocarp cells contain large amount of chloroplasts.Peel of the fruit of the development of 70-150 d gradually change from green to yellow.The distribution of chloroplast in the outer cell decreased gradually.The development 150D pummelo exocarp secrete oil cavity structure were scattered in the epicarp and oil cavity is made up of two kidney shaped cells surrounded and oil cavity voids containing many oil bodies.Exocarp cells with the distribution of yellow oil bodies, compared with the same real orange fruit exocarp, oil volume, less quantity.

Jiangyong pomelo; frozen section; secretory structures; oil bodies

S666.3

A

1006-060X（2016）11-0060-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.011.019

2016-09-02

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（13B054）

蔣 昊（1987-），男，湖南衡陽市人，研究方向?yàn)橹参锇l(fā)育生物學(xué)。并列第一作者：桂茜。

阮 穎