?張 婷，左雪枝，馬 丹?

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北 荊門 448000）

油茶產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的初步研究

張 婷，左雪枝，馬 丹

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北 荊門 448000）

試驗通過對前期從油茶中分離出的內(nèi)生真菌進行液體發(fā)酵培養(yǎng)、濃縮發(fā)酵液等操作獲得菌株的次生代謝產(chǎn)物，繼而通過鹽酸-鎂粉顏色反應(yīng)初篩和薄層層析法復篩，得到2株具有產(chǎn)黃酮能力的內(nèi)生真菌。這2株內(nèi)生真菌經(jīng)形態(tài)學鑒定分屬于青霉屬（Penicillium）和鏈格孢屬（Alternaria），并測得發(fā)酵液中的黃酮含量分別為0.0113和0.0135mg/mL。

油茶；內(nèi)生真菌；黃酮；青霉屬；鏈格孢屬

油茶（Camellia oleifera），屬山茶科山茶屬，為我國南方特有的木本油料，與油棕、油橄欖、椰子并稱為世界四大木本油料。油茶除了主要產(chǎn)品茶油外，還具有多種生理活性物質(zhì)如皂素、多酚、黃酮等，它們具有抗氧化、抑菌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種功能，可用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域。目前，這些物質(zhì)主要從茶枯餅或茶籽殼中提取，由于提取率不高，難以富集，造成原本低廉的茶枯餅或茶籽殼價格一路攀升[1-2]。

自1993年從短葉紫杉中發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，植物內(nèi)生真菌就以一種潛在的、有極大應(yīng)用價值的微生物資源進入研究人員的視野，引起了廣泛的關(guān)注。植物內(nèi)生真菌（plant endophytic fungi）是指在健康植物的組織和器官寄生并度過全部或近全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)出任何癥狀的一類真菌[3]。內(nèi)生真菌物種豐富，數(shù)量龐大，幾乎每種植物中都可以分離出少則數(shù)十種多則上百種的內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌對植物中某些活性成分的形成有重要影響，甚至會產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分，而內(nèi)生真菌又具有生長和繁殖快速、培養(yǎng)簡便、成本低廉等優(yōu)點，從內(nèi)生真菌中獲得生理活性物質(zhì)不僅可以突破植物資源缺乏、再生周期長等限制，而且利用工業(yè)化發(fā)酵可以實現(xiàn)天然活性化合物成本低、無污染的大規(guī)模生產(chǎn)。

目前鮮有關(guān)于油茶內(nèi)生真菌的報道，僅周生亮等[4]利用rDNA ITS免培養(yǎng)法從油茶葉片獲得12種內(nèi)生真菌的序列，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析全部為子囊菌，其中曲霉屬（Aspergillus）為優(yōu)勢屬，而有關(guān)油茶內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究尚未報道。本研究對油茶根莖葉中分離到的內(nèi)生真菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過顏色反應(yīng)和薄層層析法初步篩選出產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌，并對它們進行了形態(tài)學鑒定和產(chǎn)黃酮能力初測，為摸索油茶生理活性物質(zhì)新的生產(chǎn)途徑提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

采用傳統(tǒng)的組織塊分離法從健康的油茶樣品中分離出內(nèi)生真菌，純化后保存于該校微生物實驗室。

1.2內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)

將保存的菌種在28℃活化培養(yǎng)，然后挑取兩環(huán)菌種接入250 mL PDA液體培養(yǎng)基中，每3個菌種接入同一個錐形瓶，28℃、120 r/min恒溫搖床培養(yǎng)7 d。

1.3發(fā)酵液及菌絲的處理

液體發(fā)酵7 d后，將發(fā)酵液進行真空抽濾，分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲處理：菌絲放于干燥箱中烘干，將干菌絲放入研缽加少許石英砂研磨成粉末狀。分別用100 mL乙酸乙酯浸泡菌絲，過夜后進行真空抽濾得到菌絲液。發(fā)酵液處理：對所得發(fā)酵液在80℃水浴鍋中進行濃縮至原來體積的1/2，再加入等體積的乙酸乙酯放置1 d。將處理好的發(fā)酵液和菌絲液混合，用分液漏斗萃取分離，留乙酸乙酯相。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙酸乙酯，得到的浸膏用濃度為60%的乙醇浸泡溶解，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.4顏色反應(yīng)初篩

利用鹽酸-鎂粉反應(yīng)對產(chǎn)黃酮菌株進行初篩。取1 mL浸膏溶解液，加入1 mL濃鹽酸和少量鎂粉，觀察顏色變化，若不明顯可稍微加熱。若有顏色反應(yīng)，需進行單個菌種發(fā)酵培養(yǎng)進行二次初篩。經(jīng)過2次初篩后，將有顏色反應(yīng)的菌種，進行復篩。

1.5薄層層析法復篩

復篩包括制板、點樣、層析、顯色和Rf值的計算。首先，稱取薄層層析硅膠12 g，羧甲基纖維素鈉0.16 g，將它們倒入研缽中，加入40 mL蒸餾水，用研磨棒沿同一個方向研磨，研磨至糊狀后，取適量加在層析板上，左右輕輕晃動層析板，使其在層析板上均勻分布，常溫晾干后，放到100℃烘箱活化1 h，此即為薄層層析板；點樣時，在距離薄層板一端1 cm處用鉛筆輕輕劃線，在線上等距離做兩個記號，用毛細管在這兩個位置上分別點蘆丁標準品溶液和待測菌液；接著把薄層層析板放入裝有擴展劑（無水乙醇與石油醚1∶1）的層析缸中層析；層析結(jié)束后用鉛筆描出溶劑前沿，待薄層層析板干后，用濃氨水熏蒸顯色檢測層析效果；對待測菌液有層析斑點的薄層層析板計算Rf值。

1.6產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定

用接種針挑取少量菌絲置于載玻片上，加1滴苯酚棉蘭染色，并用針尖將菌絲分散開，蓋好玻片即得載片標本，用顯微鏡觀察菌絲的特征、孢子的形態(tài)，對照真菌鑒定手冊[5]確定其分類地位。

1.7產(chǎn)黃酮能力測定

稱取一定量的蘆丁，干燥至重量恒定，精確稱取20 mg，放入100 mL容量瓶中，加少量60%的乙醇使其充分溶解，再用60%乙醇定容至刻度線，震蕩均勻，此時蘆丁標準品濃度為0.2 mg/mL。然后分別量取蘆丁標準液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15 mL，將所取溶液置于25 ml的容量瓶中，分別加入60%的乙醇6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL，取5%的亞硝酸鈉溶液0.8 mL分別加入溶液，混合均勻，靜置5 min再取10%的硝酸鋁0.8 mL加入容量瓶中，混合均勻，靜置5 min；再取1 mol/L的氫氧化鈉6.5 mL加入容量瓶中，混合均勻靜置12 min，用60%乙醇定容至刻度線。以60%乙醇溶液作為空白組，在510 nm處測定吸光度，將吸光值作為縱坐標，濃度作為橫坐標，繪制標準曲線。

將1.3方法中制備的產(chǎn)黃酮菌株的代謝物溶液，從中取10 mL按蘆丁測定吸光值的方法測出吸光度，根據(jù)標準曲線計算黃酮的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1顏色反應(yīng)初篩結(jié)果

前期從油茶樣品中共分離得到的內(nèi)生真菌24株，對每株菌分別命名，依次為COEF-1、COEF-2、…、COEF-24。

將24株內(nèi)生菌3個為一組進行混合液體發(fā)酵，發(fā)酵后經(jīng)處理，用于顏色反應(yīng)，初篩結(jié)果如表1所示。在8組液體發(fā)酵的產(chǎn)物中，有2組鹽酸-鎂粉反應(yīng)結(jié)果呈陽性的，分別是第3組、第5組，涉及到內(nèi)生真菌COEF-7、COEF-8、COEF-9、COEF-13、COEF-14、COEF-15。對這6種內(nèi)生真菌再進行單一菌種液體培養(yǎng)，培養(yǎng)后濃縮發(fā)酵液，其顏色反應(yīng)結(jié)果如表2所示，COEF-8、COEF-13的代謝產(chǎn)物反應(yīng)呈現(xiàn)陽性，提示在其生長過程中有可能產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)。

表1　第一次初篩結(jié)果

表2　第二次初篩結(jié)果

2.2薄層層析復篩結(jié)果

每個樣品薄層層析重復3次，結(jié)果顯示COEF-8和COEF-13在3次的重復試驗中均有與標準品蘆丁一致的層析斑點（表3），表明COEF-8和COEF-13極有可能產(chǎn)與蘆丁結(jié)構(gòu)類似的黃酮類化合物。

表3　薄層層析法復篩結(jié)果

2.3產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定對油茶中產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌COEF-8和COEF-13制片后鏡檢結(jié)果如圖1所示。COEF-8的孢子圖片顯示為典型的青霉屬（Penicillium），分生孢子梗直立，頂端為掃帚狀的分支；COEF-13的孢子圖片顯示其分生孢子梗短，形狀為倒梨型，鑒定為鏈格孢屬（Alternaria）。

2.4產(chǎn)黃酮的能力測定

以蘆丁濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制蘆丁標準曲線（圖2），得到回歸方程：Y=6.998 2X-0.028 8（R2=0.993 2），說明此圖中蘆丁吸光值與蘆丁濃度（0～0.12 mg/mL）線性關(guān)系良好。

圖1　COEF-8和COEF-13的顯微圖片

菌株COEF-8和菌株COEF-13經(jīng)液態(tài)發(fā)酵后測得其吸光值為0.003和0.009，利用所得的回歸方程計算得到黃酮濃度為0.004 5和0.005 4 mg/mL，所以初始菌株中產(chǎn)黃酮量分別為0.011 3和0.013 5 mg/mL。

圖2　蘆丁標準曲線

3　結(jié)論與討論

黃酮是油茶中的活性成分之一，關(guān)于油茶黃酮的獲取大多是以油茶葉、油茶餅粕、油茶殼等為原材料提取，這是傳統(tǒng)的制備方法。而內(nèi)生真菌存在于植物體內(nèi)，通常能產(chǎn)生與植株相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，若能篩選出產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，則能為油茶黃酮的獲得開辟一條新途徑。

試驗以前期從油茶中篩選出的內(nèi)生真菌為對象，開展篩選工作。液體發(fā)酵培養(yǎng)時采用了菌種混合發(fā)酵的方法，縮小篩選范圍，減小了篩選的盲目性，最終獲得的2株菌株經(jīng)形態(tài)學鑒定為鏈格孢屬和青霉屬。不僅油茶中存在能產(chǎn)黃酮的內(nèi)生菌株，在其他植物中也同樣篩選出了一些能產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌。李姝諾等[6]在對越橘內(nèi)生真菌的研究中，篩選出了2株能產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學鑒定，一株為細鏈格孢（Alternaria tenuissima），一株為無孢菌株。何映霞等[7]確定了珙桐中可產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌為煙曲霉種（Aspergillus fumigatus）。錢龍等[8]對銀杏內(nèi)生真菌進行研究，發(fā)現(xiàn)安培菌屬的白粉菌寄生菌（Anpelomyces humuli）、莖點霉屬的頭狀莖點霉（Phoma glomerata）和鐮孢屬的茄鐮孢（Fusarium solani）具有產(chǎn)黃酮的能力。從這些研究中可以看出，在能夠產(chǎn)黃酮的宿主植物中一般都能篩選出產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，但產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌的種類并不是完全一樣的，提示不同內(nèi)生真菌產(chǎn)生的黃酮的種類可能存在區(qū)別。

黃酮是一大類的化合物，基于一個母體環(huán)可衍生出多種不同結(jié)構(gòu)的黃酮類物質(zhì)。產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的篩選一般都要經(jīng)歷初篩和復篩這兩個階段。初篩主要是顏色反應(yīng)，如鹽酸-鎂粉反應(yīng)、醋酸鉛反應(yīng)、三氯化鋁反應(yīng)等，不同的顏色反應(yīng)可能提示不同結(jié)構(gòu)的黃酮物質(zhì)的存在，在試驗中只選用了鹽酸-鎂粉反應(yīng)為初篩的鑒別反應(yīng)，這可能導致其他一些產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的遺漏，因此再進一步的研究中應(yīng)多選取一些顏色反應(yīng)作為鑒別的依據(jù)；復篩時主要通過薄層層析或高效液相色譜法檢測內(nèi)生真菌所產(chǎn)的次生代謝物是否是具有與標準品相似的結(jié)構(gòu)，在越橘內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究中[6]，產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌經(jīng)薄層層析均有兩個斑點，其中一個斑點與標準品蘆丁的斑點在同一水平位置；在綬草內(nèi)生真菌的研究中[9]，發(fā)現(xiàn)了3株產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌，且其代謝產(chǎn)物在薄層層析中只有一個斑點，具有與標準品蘆丁相同的遷移率。在本研究的復篩結(jié)果中，兩種內(nèi)生真菌在薄層層析中也只跑出了一個斑點，其Rf值與蘆丁一致，說明這兩種內(nèi)生真菌所產(chǎn)的黃酮結(jié)構(gòu)可能與蘆丁類似，其產(chǎn)黃酮的能力通過分光光度法得到了較為確切的結(jié)果，來自青霉屬的COEF-8產(chǎn)黃酮量為0.011 3 mg/mL，來自鏈格孢屬的COEF-13產(chǎn)黃酮量稍高一點，為0.013 5 mg/mL，但二者均未達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。在今后的研究中，為提高產(chǎn)量可對其進行誘變處理。

[1]朱俊朋，羅 凡，王 超，等.水提—醇萃法提取油茶餅粕中茶皂素[J].食品工業(yè)，2016，37（1）：107-109.

[2]梁 帆，郭 華，周 玥.響應(yīng)面法優(yōu)化油茶籽仁黃酮提取工藝[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2015，6（6）：2084-2090.

[3]Zheng J H, Kang J C, Lei B X，et al.Diversity of endophytic fungi associated with Ginkgo iloba[J].Mycosystem，2013，32（4）：671-681.

[4]Zhou S L，Yan S Z，Wu Z Y，et al.Detection of endophytic fungi within foliar tissues of Camellia oleifera based on rDNA ITS sequences[J].Mycosystem，2013，32（5）：819-830.

[5]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W出版社，1979.

[6]李姝諾,，李亞東，王 琦.越橘產(chǎn)黃酮類化合物內(nèi)生真菌的篩選[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2009，31（5）：587-591.

[7]何映霞，冉雪琴，王嘉福.珙桐產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離和鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2008，36（3）：3-6.

[8]錢 龍，楊明飛，冉雪琴，等.銀杏產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J].山地農(nóng)業(yè)生物學報，2007，26（4）：305-310.

[9]劉紫英.產(chǎn)黃酮成分的綬草內(nèi)生真菌的鑒定[J].菌物學報，2011，30（1）：133-137.

（責任編輯：夏亞男）

Primary?Studies?on?Flavonoid-Producing?Endophytic?Fungi?Isolated?from?Camellia oleifera

ZHANG Ting，ZUO Xue-Zhi，MA dan
（College of Bioengineering, Jingchu University of Technology, Jingmen 448000, PRC）

Endophytic fungi which were isolated from Camellia oleifera are cultured in the liquid medium.A lot of secondary metabolites were obtained by condensing the zymotic fluid and analyzed with color reaction and thin layer chromatography.Eventally 2 endophytic fungi that could produce flavonoid were obtained and classified as Penicillium and Alternaria according to the morphological charactersitic.Furthermore, the flaconoid content in fermentation liquid were determined as 0.0113 mg/mL and 0.0135 mg/mL respectively.

Camellia oleifera; endophytic fungi; flavonoid; Penicillium; Alternaria

S794.4

A

1006-060X（2016）11-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.011.001

2016-09-02

湖北省教育廳科研項目（Q20134301）；校級科研基金項目（ZR201403）

張 婷（1980-），女，湖北襄陽市人，講師，主要從事微生物資源利用研究。