張永根，薛世崇，李洋，丁雪，張文佳，王曉帆，張立陽(yáng)，李高

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)反芻動(dòng)物飼料工藝條件研究

張永根，薛世崇，李洋，丁雪，張文佳，王曉帆，張立陽(yáng)，李高

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

以豆渣為原料，利用混合菌種固態(tài)發(fā)酵將其轉(zhuǎn)變成一種耐貯藏、適口性強(qiáng)反芻動(dòng)物飼料。通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)研究培養(yǎng)基組成、接種物配比、接種量及培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵品質(zhì)影響。結(jié)果表明，35℃最適溫度下培養(yǎng)基組成為豆渣?麥麩=7 ? 3，接種物配比為乳酸菌?枯草芽孢桿菌=1 ? 1，接種量5%時(shí)為最佳工藝條件。

豆渣；固態(tài)發(fā)酵；混合菌種；反芻動(dòng)物飼料；工藝條件

張永根,薛世崇,李洋,等.固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)反芻動(dòng)物飼料工藝條件研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(5):76-82.

Zhang Yonggen,Xue Shichong,Li Yang,et al.Study on fermentation process of ruminant feed in soybean dregs by solidstate fermentation[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(5):76-82.(in Chinese with English abstract)

我國(guó)是世界大豆加工主要國(guó)家之一，豆渣是加工豆油、醬油、豆腐等豆制品副產(chǎn)物（約占全豆干重15%～20%）[1]。豆渣口感粗糙、熱能低，含水量大、易腐敗變質(zhì)、運(yùn)輸困難，通常作飼料直接飼喂或廢棄。微生物發(fā)酵將豆渣轉(zhuǎn)化為反芻動(dòng)物發(fā)酵飼料，對(duì)改善我國(guó)生態(tài)環(huán)境、解決飼料資源短缺等具有現(xiàn)實(shí)意義。

潘天玲等向豆渣中添加綠色木霉、黑曲霉、啤酒酵母等菌種轉(zhuǎn)化豆渣纖維，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量達(dá)28.47%[2]。莫重文采用在豆渣中生長(zhǎng)良好，對(duì)纖維素和半纖維素降解率強(qiáng)的醬油釀造米曲霉、黑曲霉和啤酒酵母為菌種，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆渣產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量可達(dá)29.76%，比原來(lái)提高43.07%[3]。辜賴濤等利用乳酸菌、酵母菌和枯草桿菌等，對(duì)以豆渣為主的原料發(fā)酵，粗蛋白含量可達(dá)28.06%，比發(fā)酵前提高42%[4]。

然而，目前關(guān)于發(fā)酵豆渣作為動(dòng)物飼料的貯存條件研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)以豆渣為原料，添加麥麩降低發(fā)酵培養(yǎng)基底物含水率，利用枯草芽孢桿菌好氧發(fā)酵快速消耗氧氣，乳酸菌厭氧發(fā)酵將其轉(zhuǎn)變成耐貯藏、適口性強(qiáng)反芻動(dòng)物飼料，改善發(fā)酵豆渣生產(chǎn)、運(yùn)輸和飼喂條件。

1 材料與方法

1.1 材料

豆渣、麥麩：購(gòu)自哈爾濱市華森畜牧科技有限公司，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 豆渣和麥麩中常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分Table 1Conventional nutrients of the soybean dregs and wheat bran

復(fù)合乳酸菌制劑：來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院反芻教研室，主要成分包括干酪乳桿菌（L.casei），植物乳桿菌（L.plantarum）及布氏乳桿菌（L.buchneri），活菌數(shù)量大于1×108cfu·g-1。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CMCC 63501）：來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所，活菌數(shù)量大于1×106cfu·g-1。

1.2 固態(tài)發(fā)酵方法

取一定量豆渣，按照不同比例加入麥麩，并加入1%氯化鈉、0.2%硫酸銨和3%尿素混合均勻。接種不同比例復(fù)合乳酸菌制劑和枯草芽孢桿菌，混合均勻后分別裝進(jìn)聚乙烯袋（規(guī)格為300 mm×200 mm）抽真空后封口，每袋500 g，每組6個(gè)重復(fù)。選擇不同發(fā)酵溫度，培養(yǎng)45 d，發(fā)酵結(jié)束后開(kāi)袋取樣，檢測(cè)分析固態(tài)發(fā)酵豆渣發(fā)酵品質(zhì)。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇培養(yǎng)基組成、接種物配比、接種量及培養(yǎng)溫度4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，以發(fā)酵產(chǎn)物的費(fèi)氏評(píng)分作為考查指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表2。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1 發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定

固態(tài)發(fā)酵45 d后開(kāi)袋取樣，混勻各處理組發(fā)酵產(chǎn)物，采用四分法分別取10 g樣品，每組3個(gè)重復(fù)。加入蒸餾水90 mL置于4℃冰箱保存，樣品浸泡24 h后過(guò)濾，測(cè)定上清液pH。取另1份上清液，分別測(cè)定氨態(tài)氮、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸含量，氨態(tài)氮含量采用苯酚—次氯酸鈉方法測(cè)定[5]，乳酸含量采用Waters—600高效液相色譜儀測(cè)定[6]，揮發(fā)性脂肪酸含量采用日本島津GC—2010氣相色譜儀測(cè)定[7]。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Table 2Factors and the levels of orthogonal test

發(fā)酵豆渣品質(zhì)依據(jù)Kilica提出費(fèi)氏評(píng)分法綜合打分，評(píng)分80～100為優(yōu)等、60～80為良好、40～60為尚可、20～40為差、0～20為極差，共5個(gè)級(jí)別[8]。

1.4.2 發(fā)酵前后飼料中微生物數(shù)量測(cè)定

分別在固態(tài)發(fā)酵后第5、7、15、30和45天開(kāi)袋取樣，混勻各處理組發(fā)酵產(chǎn)物，采用四分法分別取10 g樣品，每組3個(gè)重復(fù)。加入無(wú)菌生理鹽水90 mL，經(jīng)30 min浸泡后，吸取各樣品浸泡液并逐級(jí)稀釋，涂布法測(cè)定乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌以及霉菌數(shù)量。MRS培養(yǎng)基測(cè)定乳酸菌數(shù)量，37℃下厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，LB培養(yǎng)基測(cè)定枯草芽孢桿菌數(shù)量，37℃下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定酵母菌和霉菌數(shù)量，28℃下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)[9]。計(jì)數(shù)單位為每克發(fā)酵飼料中所含菌落形成單位[lg（cfu·g-1）]。

1.4.3 有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)

固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，取0.5 kg左右發(fā)酵產(chǎn)物置于不封口自封袋，暴露在空氣中，通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵豆渣飼料溫度，考查其二次發(fā)酵情況。室溫條件下，每隔2 h測(cè)試自封袋內(nèi)發(fā)酵豆渣溫度，連續(xù)記錄15 d，當(dāng)中心溫度在室溫基礎(chǔ)上升高2℃時(shí)認(rèn)為呈不穩(wěn)定狀態(tài)，并測(cè)定其pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣感官評(píng)定影響

9個(gè)試驗(yàn)組在45 d發(fā)酵結(jié)束后均未出現(xiàn)腐敗氣味，其中7、8、9三組具有較濃芳香酸味，同時(shí)呈褐色，相比其他6組顏色偏深。由表3可知，1、2、3三組水分含量高于其他6個(gè)試驗(yàn)組。

2.2 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣中微生物數(shù)量影響

由表4可知，在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌含量在第5天時(shí)最多，此后逐漸降低，并趨于穩(wěn)定。由表5可知，枯草芽孢桿菌數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)小幅降低。由表6可知，在經(jīng)過(guò)45 d發(fā)酵后，各組中均存在不同數(shù)量酵母菌，但數(shù)量小于3×103cfu·g-1；除第5、7、9組外，其余六組均存在不同數(shù)量霉菌，第2組霉菌數(shù)量最大為1.2×104cfu·g-1。

2.3 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣的發(fā)酵指標(biāo)影響

由表7可知，各組pH均低于4.40，其中第6組pH最低為4.05。第4組氨態(tài)氮/總氮最低，且低于5%。各組乙酸含量相當(dāng)，但7、8兩組乳酸含量較高，乳酸/總酸也較高。根據(jù)各處理組費(fèi)氏評(píng)分可知，除第3組為良好外，其余8個(gè)處理組等級(jí)均為優(yōu)等。

表3 不同處理組中水分含量Table 3Moisture contents of different treatments(%)

表4 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣中乳酸菌數(shù)量影響Table 4Effects of different treatments on the number of lactic acid bacteria in soybean dregs by solid-state fermentation(lg cfu·g-1)

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在表2確定主要影響因素和水平基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，最好的試驗(yàn)組合為A3B1C1D2，即最佳工藝條件為培養(yǎng)基組成豆渣?麥麩=7 ? 3，接種物配比復(fù)合乳酸菌制劑?枯草芽孢桿菌=1 ?1，接種量為5%，培養(yǎng)溫度35℃。

放眼望去景德鎮(zhèn)現(xiàn)在陶瓷行業(yè)雜亂無(wú)章，零零散散，沒(méi)有規(guī)劃，大量能工巧匠在家歇業(yè)，只能打麻將、吃吃喝喝，這是要技藝失傳的節(jié)奏。只有景德鎮(zhèn)陶瓷大學(xué)學(xué)生和外來(lái)景漂在兢兢業(yè)業(yè)的為瓷器耕耘，從具有一定特色的陶溪川所吸納的人才群體就看的出來(lái)，都是院校派師生。

另外，由R值分析可知，RA>RC>RB>RD，即4個(gè)因素對(duì)費(fèi)氏評(píng)分的影響程度從大到小依次是培養(yǎng)基組成、接種量、接種物配比、發(fā)酵溫度。因此在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中要優(yōu)先考慮培養(yǎng)基組成。

2.5 有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

一般在有氧穩(wěn)定性試驗(yàn)中，pH達(dá)到5即已二次發(fā)酵，達(dá)到5.5則無(wú)法飼喂[10]。由表9可知，9個(gè)處理組的pH在第9天均小于5，而第3組pH在第11天時(shí)大于5，第13天時(shí)大于8，相比其他處理，有氧穩(wěn)定性最差，與該組較低的費(fèi)氏評(píng)分相一致。

表5 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣中枯草芽孢桿菌數(shù)量影響Table 5Effects of different treatments on the number of Bacillus subtilis in soybean dregs by solid-state fermentation (lg cfu·g-1)

表6 固態(tài)發(fā)酵結(jié)束不同試驗(yàn)組中酵母菌和霉菌數(shù)量Table 6Number of yeast and mold in different treatments after solid-state fermentation (lg cfu·g-1)

表7 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣的發(fā)酵指標(biāo)影響（鮮重基礎(chǔ)）Table 7Effects of different treatments on fermentation indices in soybean dregs by solid-state fermentation(Fresh weight basis)

表8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8Design and results of the orthogonal test

表9 不同處理組開(kāi)袋后pH隨天數(shù)變化Table 9Changes of different treatments on pH after solid-state fermentation

3 討論

3.1 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣發(fā)酵品質(zhì)影響

3.1.1 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣感官評(píng)定影響

辜瀾濤等關(guān)于混合菌種對(duì)豆渣發(fā)酵品質(zhì)改善效果的研究認(rèn)為，豆渣經(jīng)厭氧發(fā)酵后，顏色和氣味發(fā)生明顯變化，得到呈褐色，有曲香味良好品質(zhì)豆渣發(fā)酵品[4]。本試驗(yàn)中，各組顏色和氣味在發(fā)酵前后均發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)不同程度酸香氣味，無(wú)臭味或刺鼻異味，發(fā)酵成功。其中7、8、9三個(gè)處理組由于麥麩添加比例最大，發(fā)酵豆渣褐色最深，酸香味最為濃郁。

3.1.2 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣中微生物數(shù)量影響

同時(shí)，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 13092）飼料中霉菌總數(shù)允許量為4.50×104cfu·g-1，本試驗(yàn)所有處理組中霉菌總數(shù)最高為1.2×104cfu·g-1，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 13092）最高允許量，說(shuō)明發(fā)酵豆渣飼料安全。

3.1.3 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣的發(fā)酵指標(biāo)影響

發(fā)酵飼料pH、氨態(tài)氮/總氮以及有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）含量，是評(píng)定飼料品質(zhì)重要指標(biāo)。由表7可知，經(jīng)過(guò)45 d發(fā)酵，各組pH介于4.0～4.4，屬于理想pH范圍[13]。氨態(tài)氮/總氮直接反映發(fā)酵原料在發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)被分解程度，本試驗(yàn)中各處理組比值均小于8%，說(shuō)明只有少量蛋白質(zhì)被分解，發(fā)酵效果較好。

有機(jī)酸可優(yōu)化發(fā)酵飼料品質(zhì)，有機(jī)酸總量及其構(gòu)成則反映飼料發(fā)酵過(guò)程好壞，其中乳酸、乙酸和丁酸最重要。在貯存發(fā)酵過(guò)程中，乙酸是有效抗菌成分，能抑制酵母和霉菌活動(dòng)[14]，提高有氧穩(wěn)定性。乳酸所占比例越大，丁酸所占比例越小，發(fā)酵飼料品質(zhì)越好。本試驗(yàn)中未檢測(cè)到丁酸含量[15]，各組有機(jī)酸獲得較高的費(fèi)氏評(píng)分。管武太等研究表明[16]，在高粱青貯中添加乳酸菌制劑能顯著提高乳酸含量，降低乙酸、丁酸和丙酸含量，改善發(fā)酵品質(zhì)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)基底物、接種物配比、接種量、發(fā)酵溫度等因素對(duì)發(fā)酵效果有重要影響[17]。本試驗(yàn)豆渣含水量較大，質(zhì)地濕黏，添加部分麥麩作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)底物，一方面可以調(diào)節(jié)水分，另一方面可以為微生物生長(zhǎng)提供所需碳源和氮源。從表8可知，對(duì)發(fā)酵效果影響最大因素是培養(yǎng)基底物組成，隨麥麩添加量增加，發(fā)酵產(chǎn)物費(fèi)氏評(píng)分升高。考慮生產(chǎn)成本，在最佳發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，豆渣和麥麩的比例可調(diào)整為8 ? 2，甚至是9 ? 1，在生產(chǎn)理想發(fā)酵產(chǎn)物同時(shí)，縮減生產(chǎn)成本。

試驗(yàn)所選用乳酸菌和枯草芽孢桿菌均為益生菌，可促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料消化、吸收、利用，提高飼料轉(zhuǎn)化率，在防病促生長(zhǎng)中起重要作用[18]。本試驗(yàn)中，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵，一方面乳酸菌和枯草芽孢桿菌利用發(fā)酵底物提供的氮源和碳源繁殖和生長(zhǎng)，使豆渣pH迅速降低，改善飼料發(fā)酵品質(zhì)；另一方面微生物發(fā)酵過(guò)程中積累大量營(yíng)養(yǎng)豐富菌體蛋白及微生物代謝產(chǎn)物，間接提高發(fā)酵產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，隨乳酸菌添加比例升高，發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)降低。本試驗(yàn)中選用乳酸菌和枯草芽孢桿菌接種比例為1 ?1，接種量為5%，此接種比例是混菌最佳共生狀態(tài)。

菌體生長(zhǎng)隨溫度變化而改變，溫度高生長(zhǎng)快，溫度低生長(zhǎng)慢，但溫度過(guò)高會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生一定阻力[19]。由R值分析可知，本試驗(yàn)中發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵品質(zhì)影響最小，最適宜發(fā)酵溫度為35℃。

3.3 不同處理對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆渣有氧穩(wěn)定性影響

當(dāng)貯存飼料暴露于空氣中后，貯存環(huán)境從厭氧轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒鯛顟B(tài)，大量休眠微生物增殖活動(dòng)加強(qiáng)，表現(xiàn)為溫度升高[20]。一般認(rèn)為飼料中心溫度超過(guò)室溫2℃，即為不穩(wěn)定狀態(tài)，有氧穩(wěn)定性是衡量貯存料在開(kāi)袋接觸空氣后質(zhì)量指標(biāo)[21]。而本試驗(yàn)在測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物有氧穩(wěn)定性時(shí)，試驗(yàn)環(huán)境溫度變化較大，對(duì)各試驗(yàn)組溫度變化影響較大，無(wú)法根據(jù)溫度變化評(píng)價(jià)各試驗(yàn)組有氧穩(wěn)定性，因此選擇pH值作為衡量有氧穩(wěn)定性指標(biāo)。導(dǎo)致pH升高的原因，主要為以下三方面：①飼料腐敗后氨基酸發(fā)生分解代謝，產(chǎn)生游離氨對(duì)pH升高起一定作用；②梭菌發(fā)酵引起pH升高；③丁酸菌也會(huì)將碳水化合物和有機(jī)酸氧化酵解產(chǎn)生丁酸，丁酸酸性明顯弱于乳酸，導(dǎo)致pH升高。

張寧等將乳酸菌制劑添加鮮稻秸中[22]，檢測(cè)其對(duì)青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性影響。通過(guò)測(cè)定青貯飼料二次發(fā)酵過(guò)程中溫度以及發(fā)酵后pH、干物質(zhì)和有機(jī)酸含量，可知乳酸菌制劑延長(zhǎng)水稻秸青貯穩(wěn)定期。Nishino等研究，布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵，在厭氧情況下可將部分乳酸轉(zhuǎn)化成乙酸，乙酸抑制酵母菌和霉菌生長(zhǎng)，推遲二次發(fā)酵時(shí)間[23]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

4 結(jié)論

以豆渣和麥麩為原料，添加復(fù)合乳酸菌和枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榈蚿H、耐貯存的反芻動(dòng)物飼料方案切實(shí)可行。綜合感官評(píng)定和發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)確定，固態(tài)發(fā)酵最佳工藝條件：培養(yǎng)基組成中豆腐渣?麥麩=7 ? 3，接種物配比是乳酸菌?枯草芽孢桿菌=1 ? 1，接種量為5%，發(fā)酵溫度為35℃。

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Study on fermentation process of ruminant feed in soybean dregs by solid-state fermentation

ZHANG Yonggen,XUE Shichong,LI Yang,DING Xue,ZHANG Wenjia,WANG Xiaofan,ZHANG Liyang,LI Gao

(School of of Animal Sciences and Technology, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

This experiment was aimed to use the soybean dregs as raw materials and transform them into a ruminant feed with good palatability and resistant storage by solid-state fermentation of mixed bacteria.The effects of the composition of fermentation stuff,the ratio of inoculating bacteria,the quantity of inoculation and the temperature of fermentation on the quality of fermented soybean dregs were researched by L9(34)orthogonal test.It had been showed that the optimum conditions of the fermentation process were as follows.Soybean dregs ?wheat bran=7 ?3,lactic acid bacteria ?Bacillus subtilis=1 ? 1,quantity of inoculation was 5%and optimal temperature was 35℃.

soybean dregs;solid-state fermentation;mixed bacteria;ruminant feed;technological conditions

S816

A

1005-9369（2016）05-0076-07

2015-07-07

國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-37）

張永根（1962-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物生產(chǎn)。E-mail:zhangyonggen@sina.com

時(shí)間2016-5-27 14:15:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160527.1415.022.html