肖佳佳 雷有成,2 林廷文 陳 燕 高姍姍 張興國 張大全 呂光華

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都，611137； 2 海思科藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，成都，611130； 3 西南交通大學(xué)中藥研究所，成都，610031； 4 金口河森寶有限公司，樂山，614700)

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冬天麻與春天麻的有效成分比較及質(zhì)量評價

肖佳佳1雷有成1,2林廷文1陳 燕1高姍姍1張興國3張大全4呂光華1

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都，611137； 2 海思科藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，成都，611130； 3 西南交通大學(xué)中藥研究所，成都，610031； 4 金口河森寶有限公司，樂山，614700)

目的：冬天麻和春天麻為不同季節(jié)采收的天麻，其價格差異很大，但質(zhì)量差異不明確。為此，以天麻中具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性的天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷為指標(biāo)，評價兩者質(zhì)量。方法：從不同產(chǎn)地收集了15份冬天麻和11份春天麻樣品，采用HPLC-DAD法測定這3種有效成分的含量；結(jié)合性狀鑒定和統(tǒng)計學(xué)分析，比較冬天麻和春天麻的質(zhì)量，分析天麻中這3種有效成分的含量與天麻不同商品規(guī)格和產(chǎn)地之間的相關(guān)性。結(jié)果：春天麻中天麻素和對羥基苯甲醇的含量之和(0.766%，n=11)為冬天麻(0.628%，n=15)的1.22倍；春天麻中天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的含量之和(0.787%，n=11)為冬天麻(0.653%，n=15)的1.21倍；但這兩項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。四川產(chǎn)天麻中天麻素和對羥基苯甲醇之和以及這3種有效成分的含量之和均高于陜西和云南。結(jié)論：建立的HPLC法可準(zhǔn)確測定天麻中天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的含量。以這3種有效成分含量為指標(biāo)，春天麻質(zhì)量優(yōu)于冬天麻，四川產(chǎn)天麻的質(zhì)量優(yōu)于陜西和云南。

天麻；天麻素；對羥基苯甲醇；腺苷；含量測定；質(zhì)量評價

天麻為名貴中藥，具有息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)之功效；來源于蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖[1]；于立冬后至清明前采挖。冬季采挖的天麻習(xí)稱為“冬天麻”，為人工栽培，又稱為“栽培天麻”。春季采挖的天麻稱為“春天麻”或“野生天麻”。由于人工栽培的春天麻和野生天麻均有殘留的莖基，在中藥市場上常把春季采挖的栽培天麻當(dāng)成野生天麻銷售，價格較高。在商品流通中，栽培天麻(冬天麻)、野生天麻(春天麻)的性狀特征和價格差異很大，但是，基于有效成分的質(zhì)量評價未見系統(tǒng)的研究報道。

在《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2010年版中，以天麻素為指標(biāo)控制天麻的質(zhì)量；在2015年版中，則以天麻素與對羥基苯甲醇之和為天麻質(zhì)量的評價指標(biāo)[1]。而天麻含酚類、氨基酸、多糖類、甾醇類和有機酸類等多種有效成分[2-5]，尤其是天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷均對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抗驚厥、抗焦慮、催眠、鎮(zhèn)痛、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用[6-15]。這些有效成分對天麻傳統(tǒng)治療的病癥如頭痛眩暈，癲癇抽搐，手足不遂，小兒驚風(fēng)，破傷風(fēng)，肢體麻木，風(fēng)濕痹痛等有效?？梢姡炻樗亍αu基苯甲醇和腺苷均為天麻有效成分。為此，我們通過優(yōu)化供試品溶液的制備方法、色譜條件等，建立了在天麻素、對羥基苯甲醇、腺苷各成分最大吸收波長檢測的HPLC方法；并收集、測定了27份冬天麻和春天麻等不同商品規(guī)格的樣品，比較這3種有效成分的含量，評價天麻的質(zhì)量，以期為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國)，配置G1322A真空在線脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1329B自動進(jìn)樣儀，G1316A柱溫箱，G1315C二極管陣列檢測器；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；BSA224S型電子天平(d=0.1 mg)和BP211D型電子天平(d=0.01 mg)(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥 天麻素(批號：110807-200205)和腺苷(批號：110879-200202)購于中國食品藥品檢定研究院；對羥基苯甲醇(批號：H20806)購于美國Sigma-aldrich公司；乙腈為色譜純(美國Sigma-aldrich公司)；甲醇、無水乙醇等均為分析純(成都市科龍化工試劑廠)；超純水由優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)制備。

1.3 藥材 27份天麻樣品分別從四川、陜西、云南、重慶等地收，均為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖。其中，冬天麻樣品15份，春天麻樣品11份，采收種子后的天麻塊莖1份。由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室呂光華教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Alltima18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～11 min，3%～5% A;11～18 min，5% A;18～31 min，5～14% A);流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測波長220 nm(天麻素、羥基苯甲醇)和260 nm(腺苷)；進(jìn)樣量10 μL。天麻樣品中天麻素、羥基苯甲醇和腺苷的色譜峰分離均良好(圖1，圖2)。

圖1 對照品和天麻樣品在220 nm檢測的HPLC色譜圖

圖2 對照品和天麻樣品在260 nm檢測的HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備及線性范圍考察 分別精密稱取天麻素27.76 mg、對羥基苯甲醇11.27 mg和腺苷7.88 mg置于25 mL量瓶中，加60%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得到混合對照品貯備液。分別精密吸取該貯備液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，搖勻；經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，得到不同濃度梯度的對照品混合溶液。按“2.1”進(jìn)樣測定；以峰面積Y(mAU·s)對進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線性回歸，得天麻素的回歸方程為Y=1496X+97.062(r=0.9998，n=7)；對羥基苯甲醇的回歸方程為Y=3095.9X-8.7423(r=0.9999，n=7)；腺苷的回歸方程為Y=1702.5X-29.925(r=0.9997，n=7)。表明天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷在進(jìn)樣量分別為0.111～8.88 μg、0.045～3.61 μg和0.032～2.52 μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取天麻粉末(過50目篩)2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入60%甲醇25 mL，稱定重量；超聲(100 W，40 kHz)提取60 min，冷卻，再稱定重量，加60%甲醇補足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 精密度考察 取1份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次。天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷峰面積的RSD值分別為0.95%(n=6)、1.81%(n=6)、1.98%(n=6)；表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取1份供試品溶液，于制樣后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的峰面積，其RSD值分別為1.29%(n=6)、1.51%(n=6)、2.58%(n=6)；表明天麻供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性考察 取同一天麻樣品粉末，6份，分別制備成供試品溶液，測定天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的含量。其RSD值分別為0.75%(n=6)、1.51%(n=6)、2.58%(n=6)。表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 分別精密稱取1.0 g已知天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷含量的天麻樣品粉末，6份，分別加入與樣品中這3種成分含量相當(dāng)?shù)膶φ掌?.528 mg(天麻素)、0.530 mg(對羥基苯甲醇)、0.268 mg(腺苷)，制備成加樣供試品溶液，測定這3種成分的含量。其回收率分別為100.57%(n=6，天麻素)、98.77%(n=6，對羥基苯甲醇)和100.26%(n=6，腺苷)。表明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.5 天麻樣品的測定 每份天麻樣品粉末稱取2份，按“2.3”項的方法制備供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件測定天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的峰面積。根據(jù)各自回歸方程計算供試品溶液中天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的濃度以及天麻樣品粉末中這3種有效成分的含量。每份天麻藥材樣品中天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的含量以2份重復(fù)測定樣品的平均值計。27份天麻樣品有效成分的含量見表1。

2.6 冬天麻與春天麻中有效成分的比較 對15份冬天麻(S1～S15)和11份春天麻(S16～S26)中的天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的含量進(jìn)行比較，其平均值見表2。

2.7 天麻不同主產(chǎn)地樣品中有效成分的比較 在15份冬天麻樣品中，對四川、陜西和云南產(chǎn)的天麻樣品進(jìn)行比較，天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的平均含量見表3。

表1 天麻樣品的來源及天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的含量

表2 冬天麻與春天麻中有效成分比較

表3 不同主產(chǎn)地天麻中有效成分的比較

3 討論

3.1 天麻樣品的質(zhì)量評價 在本研究測定的27份天麻樣品中，天麻素和對羥基苯甲醇含量之和為0.29%～4.05%，均高于《中國藥典》(2015年版)標(biāo)準(zhǔn)，即：天麻素和對羥基苯甲醇的總量不得少于0.25%[1]。以有效成分的含量為指標(biāo)，所有天麻樣品均合格。

值得注意的是，樣品S27為采收過天麻種子的塊莖，體輕、中空，表面皺縮粗糙；根據(jù)性狀特征，質(zhì)量差；而其天麻素和對羥基苯甲醇含量之和高達(dá)4.05%，為《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的16.2倍。因此，天麻的質(zhì)量評價不能僅以有效成分含量為指標(biāo)，應(yīng)結(jié)合性狀特征。同時，天麻商品藥材中，也應(yīng)防止混入這種天麻。

3.2 冬天麻與春天麻的質(zhì)量比較 人們習(xí)慣認(rèn)為野生天麻的質(zhì)量優(yōu)于栽培天麻，二者的價格差異很大。在中藥商品銷售中，有將春季采挖的栽培天麻充當(dāng)野生天麻銷售的現(xiàn)象，難于鑒別。為此，我們根據(jù)采收季節(jié)，將收集的天麻分為冬天麻(栽培天麻)和春天麻(包括野生天麻和栽培天麻)兩類進(jìn)行了比較(表2)。春天麻中天麻素和腺苷含量分別為冬天麻的1.28倍和1.56倍；兩者中對羥基苯甲醇的含量相近。春天麻中天麻素和對羥基苯甲醇含量之和為冬天麻的1.22倍。天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的含量之和為冬天麻的1.21倍。但是，后兩項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？梢姡赃@些有效成分的含量為指標(biāo)，春天麻的質(zhì)量優(yōu)于冬天麻。然而，性狀鑒別則是冬天麻的質(zhì)量優(yōu)于春天麻。因此，以有效成分含量為指標(biāo)的鑒定結(jié)果與性狀鑒定的結(jié)果不一致；應(yīng)進(jìn)一步開展藥效學(xué)研究，評價兩者的質(zhì)量。

春天麻常有不同長度的地上莖，其有效成分含量高于冬天麻的原因可能是由于天麻在土壤中越冬、春季發(fā)芽生長過程中，植物營養(yǎng)性成分消耗，導(dǎo)致天麻質(zhì)量減輕，而天麻素和對羥基苯甲醇等有效成分的含量不減少致使在天麻中相對含量升高。此推論可從樣品S27證實：這份樣品為采收過天麻種子的天麻塊莖，體小、質(zhì)輕、中空，表面皺縮，其有效成分的含量最高。

3.3 不同主產(chǎn)地的天麻質(zhì)量比較 天麻主產(chǎn)于四川、陜西、云南等地，東北及華北各地亦產(chǎn)。為了研究天麻產(chǎn)地與天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷含量之間的相關(guān)性，從天麻主產(chǎn)地四川、陜西、云南收集了天麻樣品，進(jìn)行了比較。由于春天麻的采集時間不同，藥材性狀特征和這3種有效成分的含量差異均較大，故本文僅對13份三大主產(chǎn)地的冬天麻樣品進(jìn)行了比較(表3)。結(jié)果表明：天麻素的含量為四川產(chǎn)天麻>陜西>云南；對羥基苯甲醇含量為云南產(chǎn)天麻>四川>陜西；而腺苷含量則為陜西產(chǎn)天麻>云南和四川。這3種有效成分在這三大天麻主產(chǎn)地樣品中的含量各不相同。根據(jù)2015年版《中國藥典》的指標(biāo)，天麻中天麻素與對羥基苯甲醇含量之和從大到小的順序：四川、云南、陜西。由此可見，天麻的質(zhì)量與產(chǎn)地有關(guān)。四川盆周山區(qū)生長野生天麻，也是天麻的主產(chǎn)地，天麻的質(zhì)量較好。

3.4 提取溶劑的選擇 根據(jù)這3種有效成分的極性及溶解性，比較了40%、50%、60%、70%、80%甲醇為溶劑提取天麻中天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的效果。結(jié)果表明，60%甲醇提取天麻素和對羥基苯甲醇的含量最高，而腺苷的含量在甲醇濃度為40%、50%、60%時相近，且60%甲醇的提取液更容易過濾。故選擇60%甲醇為提取溶劑。

3.5 檢測波長的選擇 根據(jù)HPLC-DAD在200～400 nm范圍內(nèi)在線檢測天麻素、對羥基苯甲醇和腺苷的紫外光譜，天麻素和對羥基苯甲醇的最大吸收波長為220 nm，而腺苷的最大吸收波長則為260 nm。天麻素和對羥基苯甲醇在220 nm處的吸光度分別為260 nm處吸光度的14.41倍和12.46倍，而腺苷在260 nm處的吸光度為220 nm處吸光度的1.69倍(圖1，圖2)。為了提高檢測方法的靈敏度，本研究選擇天麻素和對羥基苯甲醇的檢測波長為220 nm，腺苷的檢測波長為260 nm。

致謝：本項目由四川省科技支撐計劃項目(編號：2011NZ0058)和成都中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生科研實踐創(chuàng)新課題(編號：ky2016-014)資助。

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Comparison of Bioactive Compounds in Winter Tianma and Spring Tianma for Quality Assessment

Xiao Jiajia1，Lei Youcheng1，2，Lin Tingwen1，Chen Yan1，Gao Shanshan1，Zhang Xingguo3，Zhang Daquan4，Lyu Guanghua1

(1KeyLaboratoryofEducationMinistryinChinaforStandardizationofChineseMateriaMedica，SchoolofPharmacy，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu611137，China; 2HaiscoPharmaceuticalGroupCo.，LTD.，Chengdu611130，China; 3InstituteofChineseMateriaMedica，SouthwestJiaotongUniversity，Chengdu610031，China; 4JinkouheSenbaoCo.，LTD.，Leshan614700，China)

Objective:The prices are significant difference between Winter Tianma(WTM，harvested in winter)and Spring Tianma(STM，harvested in spring)，but their quality are not known.An HPLC method was therefore developed to quantify the amounts of gastrodin，p-hydroxybenzylalcohol and adenosine in Tianma samples，which were detected at their maximum absorbance wavelengths to assess the quality of WTM and STM.Methods:15 WTM and 11 STM samples were collected and quantified the levels of the three bioactive compounds.Combined with the morphological characteristics，the correlation between the various Tianma samples with their commercial specification and cultivation areas were further studied.Results:The results indicates that the sum of gastrodin and p-hydroxybenzylalcohol in STM(0.766%，n=11)was 1.22 folds of that in WTM(0.628%，n=15)，while the total amount of gastrodin，p-hydroxybenzylalcohol and adenosine in STM(0.787%，n=11)was 1.21 folds of that in WTM(0.653%，n=15).But their differences were not significance(P>0.05).Moreover，both the sum of gastrodin and p-hydroxybenzylalcohol，and the sum of gastrodin，p-hydroxybenzylalcohol and adenosine in WTM samples harvested in Sichuan ware higher than those in Shaanxi and Yunnan of China.Conclusion:It is concluded that the developed HPLC method is accurate to quantify the amounts of gastrodin，p-hydroxybenzylalcohol and adenosine in Tianma samples.On the basis of the three bioactive compounds，the quality of STM is better than WTM，and the quality of WTM cultivated in Sichuan of China is better than those in Shaanxi and Yunnan.

Gastrodia Tuber; Gastrodin; P-hydroxybenzylalcohol; Adenosine; Quantification; Quality assessment

四川省科技支撐計劃項目(編號：2011NZ0058)——川天麻新品種選育及其栽培配套技術(shù)的研究，負(fù)責(zé)人：呂光華

呂光華，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：從事中藥鑒定及資源利用，Tel:(028)61800232，E-mail：lughcd@aliyun.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.004