羅文艷　段和祥

（1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科　江西　南昌　330003；2江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院　南昌　330029）

蔞蒿乙酸乙酯部位體外抗乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究*

羅文艷1段和祥2#

（1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科江西南昌330003；2江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院南昌330029）

目的：研究蔞蒿乙酸乙酯部位體外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。方法：蔞蒿藥材用95%乙醇提取后，用乙酸乙酯萃取獲得有效部位，作用于HBV-DNA轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞上。采用MTT法檢測(cè)乙酸乙酯部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），用ELISA法觀察乙酸乙酯部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制作用。結(jié)果：蔞蒿乙酸乙酯部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞有一定的細(xì)胞抑制作用，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg表達(dá)有不同程度的抗原抑制作用。結(jié)論：蔞蒿乙酸乙酯部位有較強(qiáng)的抗乙型肝炎病毒作用。

乙型肝炎病毒；蔞蒿乙酸乙酯部位；乙型肝炎病毒表面抗原；乙型肝炎病毒e抗原

1　儀器與材料

1.1儀器設(shè)備Forma3131三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fishier公司），ST-360酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司），ST16R低溫離心機(jī)（Thermo Fishier公司），Synergguv超純水儀（Millipore公司），凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2材料蔞蒿藥材采自鄱陽湖畔草灘，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院袁桂平主任中藥師鑒定為菊科蒿屬植物蔞蒿的全草。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國GIBCO公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）均購于Sigma公司；青霉素、鏈霉素（上海先鋒藥業(yè)有限公司）；HBsAg檢測(cè)試劑盒、HBeAg檢測(cè)試劑盒（美國BD公司）；其余試劑均為分析純。

1.3細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)HepG2.2.15是HBV-DNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染HepG2而建立的HepG2.2.15細(xì)胞株，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與醫(yī)學(xué)輻射學(xué)研究所提供，培養(yǎng)基為DMEM高糖型培養(yǎng)基，含10% FBS，0.2 mg/ml的G418，用前加入100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素。

2　方法

2.1樣品的制備稱取鮮蔞蒿1.0 kg，切碎，晾干，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并回流液，回收乙醇，濃縮至干浸膏，加適量的水使溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，棄去石油醚與三氯甲烷萃取液，取乙酸乙酯萃取液，濃縮蒸干，即得蔞蒿的乙酸乙酯部位。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)在長滿HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25%胰蛋白酶消化、傳代、保種。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用DMEM高糖型培養(yǎng)基制備成1×105個(gè)/ml的混懸液，按每孔100 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長成單層后，每孔加入含有不同濃度的藥物（蔞蒿乙酸乙酯部位用培養(yǎng)基系列倍比稀釋，制備成0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 mg/ml等7個(gè)不同濃度），每個(gè)濃度平行4個(gè)孔。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組（不含藥液的細(xì)胞培養(yǎng)液）及空白對(duì)照組（僅含培養(yǎng)液）。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天更換1次新鮮的培養(yǎng)液，10 d后，取上清液，用ELISA法計(jì)算抗原抑制率，余下細(xì)胞用MTT法測(cè)定半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果測(cè)定取“2.2”項(xiàng)下的上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀于450 nm的波長處測(cè)定OD值。余下細(xì)胞，每孔加0.2 ml新鮮配制的含有0.2 ml MTT的無血清培養(yǎng)基，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，以3 000 r/min的速度離心5 min，倒出上清液，加0.2 ml DMSO溶解MTT甲臜沉淀，超聲5 min后，用酶標(biāo)儀于570 nm下測(cè)定OD值。按（1-OD給藥組/OD對(duì)照組）×100%計(jì)算抑制率。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

藥液對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的IC50值為2.55 mg/ml，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的IC50值分別為48.52 mg/ml和1.86 mg/ml。見表1。

表1　蔞蒿提取物乙酸乙酯部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞及其分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用（±s）

表1　蔞蒿提取物乙酸乙酯部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞及其分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

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4　討論

由表1的結(jié)果可見，蔞蒿提取物乙酸乙酯部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞及其分泌HBsAg、HBeAg具有明顯的抑制作用，并且抑制率的大小與濃度成正比。這為進(jìn)一步分離、純化、鑒定乙酸乙酯部位抗乙型肝炎病毒的活性成分提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。本課題組前期研究了蔞蒿乙酸乙酯部位的化學(xué)成分，并首次從蔞蒿藥材中分離鑒定出反式白藜蘆醇等11種化學(xué)成分[8]。白藜蘆醇是一種生物活性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9]，也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇及其衍生物有一定的抗乙型肝炎病毒的作用。

乙型肝炎是一種損害肝臟的病毒感染，可造成急性或慢性疾病。從中國疾病預(yù)防控制中心獲悉，我國現(xiàn)有約9000萬慢性乙肝病毒感染者，其中約2800萬為慢性乙肝患者，每年約有90萬發(fā)展為肝硬化，約30萬發(fā)展為原發(fā)性肝癌。在全球肝癌發(fā)病和死亡人數(shù)最多的20個(gè)國家中，我國排在首位。我國人口約占全球人口的20%，但肝癌發(fā)生及死亡人數(shù)占全球的50%以上。雖然我國中藥資源非常豐富，但從廣闊的中藥資源庫中研究并開發(fā)出一種高效低毒的抗HBV的藥物，還有很長一段路要走。

目前，通常是利用活性指導(dǎo)下的靶向追蹤分離技術(shù)，把目標(biāo)藥物作用于HBV-DNA轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)目標(biāo)藥物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的IC50，用ELISA法觀察目標(biāo)藥物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究抗乙型肝炎病毒的活性化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，得到一系列抗乙型肝炎病毒的活性成分，研究和開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效低毒的抗腫瘤藥物奠定了基礎(chǔ)。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志(第七十六卷第二冊(cè))[M].北京:科學(xué)出版社,1991.144

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[3]李曉明,劉躍鈞,鄧榮華,等.蘆蒿不同部位清除自由基活性研究[J].食品與機(jī)械,2012,28(5):116-119

[4]宇宙,胡居吾,付俊鶴,等.野生藜蒿提取物降壓作用研究[J].食品工業(yè)科技,2010(6):306-309

[5]LuZhang,Zong-caiTu,TaoYuan,etal.Solventoptimization, antioxidant activity,and chemical characterization of extracts from Artemisia selengnesis Turcz[J].Industrial Crops and Products, 2014,56(5):223-230

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[8]段和祥,羅文艷,楊毅生,等.蔞蒿醋酸乙酯部位化學(xué)成分研究[J].中草藥,2015,46(10):1441-1444

[9]周俠,呂秋軍,王林,等.白藜蘆醇及其衍生物抗乙型肝炎病毒體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥學(xué)雜志,2005,40(24):1904-1906

Experimental study on Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis anti-HBV in vitro

LUO Wen-yan1,DUAN He-xiang2#
(1Department of Pharmacy,The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang330003; 2Jiangxi Institute for Drug Control,Nanchang330029)

Objective:To study the effect of ethyl acetate from Artemisia selengensis anti-HBV in vitro.Methods:After the Artemisia selengensis were extracted with 95%ethanol,extracted with ethyl acetate.Then the effective part was acted on HBV-DNA transfected HepG2.2.15 cells.MTT assay was used to detect ethyl acetate fraction inhibitory concentration 50%of HepG2.2.15 cells. ELISA method was used to investigate the suppressor effect on HBsAg and HBeAg in the cultured HepG2.2.15 cells which were gene transferred with HBV.Results:Ethyl acetate fration from Artemisia selengensis have a certain cell inhibitory effect on HepG2.2.15 cells. HepG2.2.15 cells the secretion of HBsAg and HBeAg express different degrees of antigen inhibition.Conclusion:The ethyl acetate from Artemisia has strong anti HBV effect.

HBV;Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis;HBsAg;HBeAg

R285.5[1]。全草入藥，性平味甘，有止血消炎、鎮(zhèn)咳化痰、開胃健脾、散寒除濕等功效[2]。目前，針對(duì)蔞蒿的研究主要集中在抗菌、抗氧化、降壓、抗腫瘤等活性物質(zhì)及其藥理活性方面[3～7]，而蔞蒿抗乙型肝炎的功效，尚未引起人們的重視。本試驗(yàn)采用MTT法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA），研究了蔞蒿乙酸乙酯部位對(duì)體外乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的抑制作用?，F(xiàn)報(bào)告如下：

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.09.045蔞蒿（Artemisia selengensis Turcz.ex Bess.）為菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia Linn.）植物，俗名藜蒿，在我國各地均有分布，但以生長在長江中下游的鄱陽湖、洞庭湖和太湖等地區(qū)的品質(zhì)為佳

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)指導(dǎo)性計(jì)劃（編號(hào)：2013B014）；

江西省科技廳青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：20122BAB215044）

段和祥，E-mail：duanhx_007@163.com

（2016-06-02）