祝海娟，劉大偉，張艷菊，白玲玲，楊佳樂

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

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黃瓜霜霉病菌對甲霜靈的抗藥性

祝海娟，劉大偉，張艷菊*，白玲玲，楊佳樂

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

本研究采用葉盤漂浮法測定了來自黑龍江省、吉林省、遼寧省、北京、山東省、江蘇省、湖北省和廣東省8個省份13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)的36個黃瓜霜霉病菌株對甲霜靈的抗藥性。結(jié)果表明，黃瓜霜霉菌對甲霜靈的EC50值為1.3277～171.5480 μg/mL，平均EC50值為64.6782 μg/mL；36株菌株中，有3個中抗菌株，占總菌株數(shù)的8.3 %；33個高抗菌株，占91.7 %，為優(yōu)勢群體，無敏感菌株和低抗菌株。各地區(qū)采集的黃瓜霜霉菌對甲霜靈抗性水平范圍28.25～3649.96倍，平均抗性水平為1376.13倍；除黑龍江省齊齊哈爾檢測到1株中抗菌株和遼寧省海城檢測到2株中抗菌株外，其余菌株對甲霜靈的抗性水平均超過100倍，表明多數(shù)菌株對甲霜靈已經(jīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥性。

黃瓜霜霉菌；抗藥性；甲霜靈

由藻界卵菌綱古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk. & M.A. Curtis) Rostovzev]侵染引起的霜霉病是黃瓜生產(chǎn)上最常見、最主要、造成損失最嚴(yán)重的病害，廣泛分布于世界各地，在適宜的環(huán)境條件下，傳播流行速度快，涉及范圍廣，是黃瓜生產(chǎn)中的一種毀滅性病害[1]，俗稱“跑馬干”、“黑毛”、“瘟病”。據(jù)載這種病害先后在全世界約70多個國家有發(fā)生，極大的威脅著黃瓜的生產(chǎn)[2]。目前對于該病害的防治主要根據(jù)其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，通過抗病品種的使用、生態(tài)防治以及化學(xué)防治等措施的協(xié)調(diào)運(yùn)用進(jìn)行綜合防治。甲霜靈是目前生產(chǎn)上常用的殺菌劑，由于使用頻率高，劑量大，且連年使用，導(dǎo)致病菌抗藥性逐步增強(qiáng)，致使防治效果下降。

甲霜靈(metalaxyl)是一種苯基酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，又被稱為瑞毒霉、甲霜安、雷多米爾等，具有良好的保護(hù)和治療作用[3]，是卵菌病害防治的常用藥劑之一。

苯基酰胺類殺菌劑包括?；匪犷?甲霜靈、呋霜靈、苯霜靈)、丁酸內(nèi)酯類(甲呋酰胺)和惡霉靈。其作用機(jī)制主要是抑制病原菌rRNA聚合酶，進(jìn)而抑制rRNA的合成。此類殺菌劑為特異性位點(diǎn)抑制劑，特征是對病原菌某一個作用位點(diǎn)起作用，即只對病原菌的單一代謝環(huán)節(jié)起作用，如果此位點(diǎn)發(fā)生突變，藥劑將不能與其產(chǎn)生作用，因此容易導(dǎo)致病原菌對藥劑產(chǎn)生抗藥性。同時(shí)，該類藥劑之間存在交互抗藥性，而且抗性水平普遍較高，并能穩(wěn)定遺傳[4]。黃瓜霜霉菌對苯基酰胺類殺菌劑的抗藥性，是植物病原菌抗藥性突出的問題之一[5-8]。1980年以色列首次報(bào)道甲霜靈對黃瓜霜霉病的防治失敗[9]，之后歐洲等地發(fā)現(xiàn)霜霉菌對甲霜靈產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性.。Urban等2001-2004年在捷克9個地方采集了98株黃瓜霜霉菌，測定其對甲霜靈的抗藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株對甲霜靈已產(chǎn)生明顯的抗藥性。我國使用甲霜靈進(jìn)行黃瓜霜霉病防治相較于歐洲國家稍晚，1979-1986年，甲霜靈才被廣泛應(yīng)用于防治黃瓜霜霉病。1990年，黃瓜霜霉菌對甲霜靈的抗藥性已是高抗水平，在北京、保定等地普遍存在高抗菌株。王文橋等通過對黃瓜霜霉菌標(biāo)樣進(jìn)行抗藥性監(jiān)測發(fā)現(xiàn)黃瓜霜霉菌對甲霜靈已普遍產(chǎn)生不同程度的抗藥性，而且發(fā)現(xiàn)甲霜靈與惡唑烷酮之間存在正交互抗性關(guān)系[10]。本文研究了來自我國8個省13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)霜霉菌對甲霜靈的抗藥性，為科學(xué)防治黃瓜霜霉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試黃瓜品種 感病黃瓜品系L18，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組提供。在溫室內(nèi)種植，正常管理。

1.1.2 病原菌 2012-2013年，在黃瓜霜霉病發(fā)病盛期，從黑龍江省、吉林省、遼寧省、北京、山東省、江蘇省、湖北省和廣東省8個省份13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)的大田或溫室中采集黃瓜霜霉病葉(表1)，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

續(xù)表1 Continued table 1

編號Code菌株Isolate采集時(shí)間Acquisitiontime來源Origin27Pc?sd62013山東省壽光市留呂鎮(zhèn)留呂村28Pc?sd72013山東省壽光市留呂鎮(zhèn)留呂村29Pc?js12012江蘇省連云港市東海縣李埝鄉(xiāng)林場30Pc?js22012江蘇省連云港市東?？h李埝鄉(xiāng)林場31Pc?js32012江蘇省連云港市東?？h李埝鄉(xiāng)林場32Pc?hb12012湖北省武漢市武昌區(qū)獅子山華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場33Pc?hb22012湖北省武漢市武昌區(qū)獅子山華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場34Pc?hb32012湖北省武漢市武昌區(qū)獅子山華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場35Pc?gd12012廣東省廣州市五山區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)周邊36Pc?gd22012廣東省廣州市五山區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)周邊

1.1.3供試藥劑 97 %甲霜靈(metalaxyl)原藥，由先正達(dá)(中國)投資有限公司提供。將上述原藥用丙酮溶解配制成1×104μg/mL的母液，放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。對離體葉盤進(jìn)行藥劑處理時(shí)，將母液用無菌水稀釋成0、0.01、0.1、1、5、10、50、100和500 μg/mL的系列濃度梯度的藥液，并加入0.005 %的吐溫20。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株對甲霜靈的敏感性測定 采用離體葉盤漂浮法測定36株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感性[11]。采集健康黃瓜植株上葉片全展的第3～5片葉，用打孔器制備成直徑為15 mm的葉盤，準(zhǔn)備直徑90 mm的培養(yǎng)皿若干，每皿加入10片葉盤，加入15 mL藥液，葉盤背面朝上置于不同系列濃度藥液中浸泡l h，對照加蒸餾水，每濃度重復(fù)3次。將配制好的2×103個孢子囊/mL懸浮液點(diǎn)滴1滴10 μl接種于葉盤中心點(diǎn)，置于12 h光暗交替的培養(yǎng)箱中，RH>80 %、培養(yǎng)箱溫度為18 ℃。培養(yǎng)7 d后測量葉盤上的發(fā)病面積，計(jì)算防治效果。

病情調(diào)查：根據(jù)病斑面積占葉盤面積的百分率劃分病級：0 級：無病斑；1 級：病斑占整個葉片<5 %；3級：病斑占整個葉片的5 %～25 %；5 級：病斑占整個葉片的26 %～50 %；7 級：病斑占整個葉片的51 %～75 %；9級：病斑占整個葉片>75 %。

通過DPS軟件，進(jìn)行藥劑濃度與防效之間的線性回歸分析，將防效轉(zhuǎn)化為機(jī)率值(Y)，藥劑濃度(μg/mL)轉(zhuǎn)化為負(fù)對數(shù)(X)，求出毒力回歸方程Y=A+BX，相關(guān)系數(shù)R2，并根據(jù)方程計(jì)算4種藥劑對不同菌株的有效抑制中濃度EC50(μg/mL)。

防治效果( %)=

1.2.2 菌株對甲霜靈的抗性水平及抗藥類型 黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感基線采用王文橋等測得的敏感基線：0.0470 μg/mL[7]；根據(jù)黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感基線值，由下式求出各菌株對甲霜靈的抗性水平。

參照抗藥類型分級標(biāo)準(zhǔn)[10]，根據(jù)抗性水平將不同的黃瓜霜霉菌分為4個類型：敏感型S：抗性水平≤2倍；低抗型LR：2<抗性水平≤10倍；中抗型MR：10<抗性水平≤100倍；高抗型HR：抗性水平>100。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株對甲霜靈的敏感性測定

36 株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感性進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。對甲霜靈最不敏感菌株的EC50值為171.5480 μg/mL，最敏感菌株的EC50值為1.3277 μg/mL，菌株之間EC50值變化范圍較大，表明供試的不同菌株之間對甲霜靈敏感性差異較大，最大值是最小值的129.20倍，平均EC50值為64.6782 μg/mL。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，來源于不同地區(qū)的菌株對甲霜靈的平均 EC50值存在明顯差異，每個省的平均 EC50分布范圍為18.8618～100.4303 μg/mL，遼寧省的平均 EC50值最小為18.8618 μg/mL，江蘇省的平均 EC50值最大為100.4303 μg/mL，最大值是最小值的5.32倍。不同年份采集的菌株對甲霜靈敏感性不同，2012年采集的17個菌株的EC50分布范圍為12.0508～171.5480 μg/mL，平均EC50值為78.9277 μg/mL；2013年采集的19個菌株的EC50分布范圍為1.3277～116.7299 μg/mL，平均EC50值為51.9287 μg/mL。

表2 黃瓜霜霉病菌對甲霜靈的敏感性

2.2 菌株對甲霜靈的抗性水平

本試驗(yàn)中黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感基線采用王文橋等測得的敏感基線：0.0470 μg/mL。將采集到的36株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的抗藥性進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。36個菌株中，有3個中抗菌株，占總菌株數(shù)的8.3 %；33個高抗菌株，占91.7 %，為優(yōu)勢群體；無敏感菌株和低抗菌株。各地區(qū)采集的黃瓜霜霉菌對甲霜靈抗性水平范圍28.25～3649.96倍，平均抗性水平為1376.13倍；除黑龍江省齊齊哈爾檢測到1株中抗菌株和遼寧省海城檢測到2株中抗菌株外，其余菌株對甲霜靈的抗性水平均超過100倍，表明多數(shù)菌株對甲霜靈已經(jīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥性。2012年采集的17個菌株均為高抗菌株，2013年采集的19個菌株中有16個高抗菌株和3個中抗菌株。

表3 黃瓜霜霉菌對甲霜靈的抗性水平

注：HR和MR分別表示高抗菌株和中抗菌株。

Note：HR and MR respectively represent high resistant and mean resistant isolates.

3 討 論

將36 株黃瓜霜霉菌進(jìn)行了甲霜靈的敏感性測定，結(jié)果顯示，對甲霜靈的EC50值為1.3277～171.5480 μg/mL，菌株之間EC50值變化范圍較大，平均EC50值為64.6782 μg/mL，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，來源于不同地區(qū)的菌株對甲霜靈的平均 EC50值存在明顯差異，遼寧省的平均 EC50值最小為18.8618 μg/mL，江蘇省的平均 EC50值最大為100.4303 μg/mL。不同年份采集的菌株對甲霜靈敏感性不同，2012年采集的17個菌株均為高抗菌株，平均EC50值為78.9277 μg/mL；2013年采集的19個菌株中有16個高抗菌株和3個中抗菌株，平均EC50值為51.9287 μg/mL。對甲霜靈的抗藥性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36個菌株中有3個中抗菌株和33個高抗菌株，無敏感菌株，表明我國黃瓜霜霉菌對甲霜靈普遍產(chǎn)生較高的抗性，因此，應(yīng)控制甲霜靈的單獨(dú)使用，提倡甲霜靈與廣譜性、保護(hù)性殺菌劑混用，以增加其防治效果，減少病原菌選擇壓力，防止抗性的快速上升，同時(shí)能夠減少環(huán)境污染，降低成本。

為了避免長期單一使用一種殺菌劑，應(yīng)合理進(jìn)行殺菌劑的輪換和使用，嚴(yán)格控制抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的殺菌劑在單季的使用次數(shù)，進(jìn)而在一定程度上降低藥劑的選擇壓力，利于減少適合度低的抗藥性菌株群體數(shù)量，延緩或克服抗藥性的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)還要加強(qiáng)病害短期預(yù)測預(yù)報(bào)，指導(dǎo)農(nóng)民科學(xué)用藥，嚴(yán)格按照藥劑生產(chǎn)商的推薦劑量施藥，以達(dá)到降低抗藥性產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)，延長藥劑使用壽命，減少環(huán)境污染，降低病害防治成本的目的。

4 結(jié) 論

采用葉盤漂浮法測定了來自黑龍江省、吉林省、遼寧省、北京、山東省、江蘇省、湖北省和廣東省8個省份13個黃瓜主產(chǎn)區(qū)的36株黃瓜霜霉菌對甲霜靈的敏感性。黃瓜霜霉菌對甲霜靈的EC50值為1.3277～171.5480 μg/mL，平均EC50值為64.6782 μg/mL。36株菌株中，有3個中抗菌株，占總菌株數(shù)的8.3 %；33個高抗菌株，占91.7 %，為優(yōu)勢群體；無敏感菌株和低抗菌株。

[1]張艷菊，張宏宇，秦智偉，等．黃瓜霜霉菌毒性及分子多態(tài)性分析[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(2)：25-30．

[2]石延霞. 黃瓜霜霉病菌侵染模擬、致病機(jī)理和高溫誘導(dǎo)抗病性的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[3]馬志強(qiáng)，張小風(fēng)，韓秀英，等．黃瓜霜霉病菌對甲霜靈的抗藥性治理[J]．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2005，32(2)：223．

[4]高智謀，鄭小波，陸家云．疫霉菌對殺菌劑抗性遺傳研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999， 26(2)：155-161．

[5]閆秀琴，劉慧平，韓巨才，等. 我國植物病原菌抗藥性的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥，2001(12)：4-6.

[6]王文橋，劉國容．致病疫霉對惡唑烷酮和霜脲氰的固有抗藥風(fēng)險(xiǎn)研究[J]．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1995，10(增刊)：157-162．

[7]王文橋，劉國容，嚴(yán)樂恩，等．黃瓜和葡萄霜霉病菌的抗藥性監(jiān)測[J]．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，19(增刊)：127-131．

[8]李 煒，張志銘， 李 川. 馬鈴薯晚疫病菌對瑞毒稱抗性的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998, 21(3)：53-59.

[9]Reuveni M, EyalH, Cohen Y. Development of resistance to metalaxyl in Pseudoperonospora cubensis[J]. Plant Disease, 1980, 64:1108-1109.

[10]王文橋，劉國容．卵菌對內(nèi)吸殺菌劑的抗藥性及對策[J]．植物病理學(xué)報(bào)，1996，26(4)：294-296．

[11]張艷菊．黑龍江黃瓜霜霉病初侵染源及生理小種分化[D]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2006．

[12]王文橋，劉國容，嚴(yán)樂恩，等．黃瓜和葡萄霜霉病菌對不同內(nèi)吸殺菌劑的交互抗藥性[J]．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1996，23(1)：84-88．

(責(zé)任編輯 李山云)

Study on Resistance ofPseudoperonosporacubensisto Metalaxyl

ZHU Hai-juan, LIU Da-wei, ZHANG Yan-ju*, BAI Ling-ling, YANG Jia-le

(College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Helongjiang Harbin 150030,China)

36 strains of cucumber downy mildew in cucumber which were collected from 13 main producing areas in China were investigated to study their resistance to the metalaxyl, the toxicity of metalaxyl toP.cubensiswas determined with leaf disk floating method. The result showed that EC50ofP.cubensisto metalaxyl was 1.3277-171.5480 μg/mL, with the average EC50of 64.6782 μg/mL. There were 3 moderate resistant isolates, accounting for 8.3 % of 36 isolates,33 high resistance isolates, accounting for 91.7 %, were dominant group, and there was non-sensitivity isolate and low resistance isolate. Fungicides sensitivity ofPseudoperonosporacubensisin all areas to metalaxyl was 28.25-3649.96 times, and the mean resistance was 1376.13 times. Except one in Heilongjiang and two isolates in Liaoning were moderately resistant, other isolates were more than 100 times, which indicated that most of the isolates had a very strong resistance to metalaxyl.

Pseudoperonosporacubensis; Fungicide resistance; Metalaxyl

1001-4829(2016)08-1969-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.020

2015-09-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171792)；黑龍江省自然科學(xué)基金(C201428)

祝海娟(1990-)，吉林洮南人，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病理學(xué)，E-mail:1255250662@qq.com,*為通訊作者。

S436.3

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