曹亞峰，衣 昕

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦區(qū)中心醫(yī)院血液科，上海 200090；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，江蘇南通 226001)

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·經(jīng)驗(yàn)交流·

胰腺癌細(xì)胞中TGF-β1對Foxp3表達(dá)的影響

曹亞峰1，衣 昕2△

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦區(qū)中心醫(yī)院血液科，上海 200090；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，江蘇南通 226001)

目的 探討胰腺癌細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)對正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的影響。方法 利用Transwell小室建立胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1與PBMC的共培養(yǎng)體系，分為A組(PBMC)，B組(PBMC-CF-PAC1)，C組[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗體(1 μL)]，D組[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗體(2 μL)]，E組[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗體(4 μL)]，F(xiàn)組[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗體(8 μL)]，G組[PBMC-CF-PAC1+TGF-β1抗體(16 μL)]。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測共培養(yǎng)體系中加入TGF-β1抗體前、后細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1的水平。采用Western blot法、免疫熒光方法檢測共培養(yǎng)體系中加入TGF-β1抗體前、后PBMC中Foxp3的表達(dá)量。結(jié)果 A組TGF-β1平均濃度為(12.44±2.08)ng/mL，B組TGF-β1平均濃度為(14.12±1.25)ng/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著加入TGF-β1抗體濃度的增加，各組TGF-β1水平呈遞減趨勢(P<0.05)。B組PBMC中Foxp3蛋白相對表達(dá)量明顯高于A組(P<0.05)，其余6組PBMC細(xì)胞中Foxp3蛋白的表達(dá)量隨著加入TGF-β1抗體濃度的增加，呈遞減趨勢(P<0.05)。結(jié)論 胰腺癌細(xì)胞可通過調(diào)整腫瘤微環(huán)境中TGF-β1影響PBMC細(xì)胞中Foxp3蛋白的表達(dá)。

胰腺腫瘤；受體，轉(zhuǎn)化生長因子β；外周血單個(gè)核細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1；Foxp3

Sakaguchi等[1]學(xué)者研究證實(shí)天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)具有免疫抑制作用，此類細(xì)胞以“主動(dòng)”的方式調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答及免疫耐受，在移植免疫、腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)機(jī)體逐漸形成惡性腫瘤時(shí)，Treg細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在內(nèi)的免疫抑制因子，顯著抑制抗腫瘤免疫。Foxp3在構(gòu)建Treg體系中起主導(dǎo)作用，對Treg的形成和功能發(fā)揮具有重要的作用，是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，被認(rèn)為是Treg細(xì)胞標(biāo)志性分子[2-3]。本研究采用正常人外周血中分離出正常人外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1、利用Transwell小室建立胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1與PBMC的共培養(yǎng)體系，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測共培養(yǎng)體系中加入TGF-β1抗體前、后細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平。采用Western blot法、免疫熒光方法檢測共培養(yǎng)體系中加入TGF-β1抗體前、后PBMC細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)量。本研究欲了解TGF-β1與Foxp3之間的關(guān)系，以期通過調(diào)控TGF-β1來影響Treg功能和數(shù)量以便進(jìn)一步發(fā)揮機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年9月1日至2013年5月31日期間體檢無特殊的健康人外周血，提取PBMC。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的提取 提取健康人PBMC。適量淋巴細(xì)胞分離液加入離心管中，肝素抗凝靜脈血與等量磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混勻，用滴管沿管壁緩慢滴混勻液于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2 000 r/min 20 min后，管內(nèi)可見3層，PBMC為主的白色云霧層狹窄帶位于上、中層界面處，用毛細(xì)吸管插到云霧層吸取PBMC，置入另一短中管中，加入5倍體積的PBS液，水平離心1 500 r/min 10 min，洗滌細(xì)胞2次。末次離心后，棄上清液，加入含有10%小牛血清的DMEM，調(diào)整PBMC濃度為2×105/mL。

1.2.2 Transwell小室建立共培養(yǎng)體系 將胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1(上海中科院細(xì)胞庫購買)調(diào)整細(xì)胞數(shù)約為2×106/孔，加入2.6 mL DMEM培養(yǎng)液于6孔板中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)；將0.4 μm Transwell小室放入6孔板中，小室內(nèi)置入1.5 mL提取得到的PBMC細(xì)胞懸液。試驗(yàn)分組如下。(1)A組：即PBMC組，共培養(yǎng)下層6孔板中，加入調(diào)整PBMC細(xì)胞數(shù)為2×106的DMEM培養(yǎng)液2.6 mL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室內(nèi)加入PBMC細(xì)胞數(shù)為2×105的DMEM培養(yǎng)液1.5 mL；(2)B組：即PBMC-CF-PAC1組。共培養(yǎng)下層6孔板中，加入胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106，DMEM培養(yǎng)液2.6 mL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室內(nèi)加入PBMC細(xì)胞數(shù)為2×105的DMEM培養(yǎng)液1.5 mL；(3)C組：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗體(1 μL)組，共培養(yǎng)下層6孔板中，加入胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106，DMEM培養(yǎng)液2.6 mL，同時(shí)加入抗TGF-β1抗體1 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室內(nèi)加入PBMC細(xì)胞數(shù)為2×105的DMEM培養(yǎng)液1.5 mL；(4)D組：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗體(2 μL)組。共培養(yǎng)下層6孔板中，加入胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106，DMEM培養(yǎng)液2.6 mL，同時(shí)加入抗TGF-β1抗體2 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室內(nèi)加入PBMC細(xì)胞數(shù)為2×105的DMEM培養(yǎng)液1.5 mL；(5)E組：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗體(4 μL)組。共培養(yǎng)下層6孔板中，加入胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106，DMEM培養(yǎng)液2.6 mL，同時(shí)加入抗TGF-β1抗體4 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室內(nèi)加入PBMC細(xì)胞數(shù)為2×105的DMEM培養(yǎng)液1.5 mL；(6)F組：即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗體(8 μL)組，共培養(yǎng)下層6孔板中，加入胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106，DMEM培養(yǎng)液2.6 mL，同時(shí)加入抗TGF-β1抗體8 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室內(nèi)加入PBMC細(xì)胞數(shù)為2×105的DMEM培養(yǎng)液1.5 mL。(7)G組，即PBMC-CF-PAC1+抗TGF-β1抗體(16 μL)組，共培養(yǎng)下層6孔板中，加入胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106，DMEM培養(yǎng)液2.6 mL，同時(shí)加入抗TGF-β1抗體16 μL，放入0.4 μm Transwell小室后，小室內(nèi)加入PBMC細(xì)胞數(shù)為2×105的DMEM培養(yǎng)液1.5 mL。

1.2.3 利用ELISA法檢測TGF-β1水平 按照TGF-β1 ELISA試劑盒(BD公司)說明書步驟，檢測培養(yǎng)液中TGF-β1的水平。

1.2.4 Western blot法檢測PBMC中Foxp3的蛋白水平 提取Transwell小室中PBMC細(xì)胞總蛋白，按Bradford法進(jìn)行蛋白總量測定，凍存于-70 ℃冰箱待用。蛋白樣品與6×上樣緩沖液混合，100 ℃水浴5 min，置冰上冷卻，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳垂直電泳進(jìn)行分離，每組上樣量45 μg，電壓120 V，溴酚藍(lán)到底后停止。Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜15 V，1 h用TBST緩沖液洗膜3次，并用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，再用兔抗Foxp3(1∶1 000，proteintech公司)，鼠抗β-actin(1∶1 500，Sigma公司)孵育，4 ℃過夜，TBST緩沖液洗滌3次后分別加入辣根過氧化物酶結(jié)合的抗兔免疫球蛋白G(IgG，北京中山金橋公司)和抗鼠IgG(北京中山金橋公司)室溫孵育4 h。 TBST緩沖液洗滌3次后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液(Pierce公司)，膠片曝光l min后顯影、定影、晾干。

1.2.5 Foxp3免疫熒光方法檢測 在EP管中加入適量0.01 mol/L PBS洗滌收集的細(xì)胞3次，0.2% Triton X-100破膜15 min，0.01 mol/L PBS洗滌10 min×3次，5%牛血清清蛋白(BSA)封閉1 h。加入鼠抗Foxp3單克隆抗體(北京中山金橋公司)4 ℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS洗滌10 min×3次，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG室溫避光孵育2 h，0.01 mol/L PBS洗滌10 min×3次，Hoechst室溫避光孵育5 min，染細(xì)胞核，雙蒸水(ddH2O)洗滌10 min×3次，甘油-Tris封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果，激發(fā)波長為488 nm和380 nm。

2 結(jié) 果

2.1ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平。

2.1.1A、B組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平的比較A組TGF-β1平均濃度為(12.44±2.08)ng/mL，B組TGF-β1平均濃度為(14.12±1.25)ng/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.1.2B、C、D、E、F和G組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平的比較 隨著加入TGF-β1抗體濃度的增加，各組TGF-β1水平呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2Westernblot法檢測各組PBMC中Foxp3蛋白表達(dá)量

2.2.1A、B組PBMC中Foxp3蛋白表達(dá)量比較Westernblot法檢測結(jié)果顯示B組PBMC中Foxp3蛋白相對表達(dá)量明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2.2B、C、D、E、F和G組PBMC中Foxp3蛋白表達(dá)量比較Westernblot法檢測結(jié)果顯示，6組PBMC細(xì)胞中Foxp3蛋白的表達(dá)量隨著加入TGF-β1抗體濃度的增加，呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

表1 6組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1水平比較

圖1 Western blot檢測A、B組PBMC中Foxp3蛋白表達(dá)量

圖2 Western blot檢測6組PBMC中Foxp3蛋白表達(dá)量

2.3Foxp3免疫熒光方法檢測

2.3.1A、B組Foxp3熒光檢測結(jié)果B組Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 A、B組Foxp3免疫熒光方法檢測結(jié)果

2.3.2B、C、D、E、F和G組Foxp3熒光檢測結(jié)果 6組Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)量隨著加入TGF-β1抗體濃度的增加，呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 6組Foxp3免疫熒光檢測結(jié)果

3 討 論

有研究表明，Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中升高,Treg細(xì)胞能夠抑制惡性腫瘤組織中CD8+T、CD4+T淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞(naturekillercells,NK)等表達(dá)，并且抑制其遷移到腫瘤局部，發(fā)揮抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)的作用[1]，但是Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中升高的機(jī)制尚不明確。

Valzasina等[4]學(xué)者在研究腫瘤負(fù)荷小鼠時(shí)觀察到，小鼠體內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化是Treg增殖的主要來源之一。有研究觀察到，TGF-β1可以促進(jìn)CD4+CD25+T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg轉(zhuǎn)化，參與了體內(nèi)Treg細(xì)胞增殖過程，進(jìn)一步促進(jìn)免疫負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)[5]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異標(biāo)志性分子Foxp3蛋白是其生長、分化和功能發(fā)揮的關(guān)鍵基因。有關(guān)試驗(yàn)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3mRNA的表達(dá)量對外周血Treg細(xì)胞數(shù)量及功能的影響有著至關(guān)重要的意義。scurfy小鼠Foxp3基因缺失，表現(xiàn)出的是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的缺失，這表明Foxp3基因是CD4+CD25+Treg細(xì)胞生長和分化過程中不可缺失的促進(jìn)因子[6-7]。由此推測，上調(diào)Foxp3基因的表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變，促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖使得腫瘤組織產(chǎn)生抑制免疫效應(yīng)。

本研究用Transwell培養(yǎng)體系模擬腫瘤微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞互相作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1可分泌一定濃度的TGF-β1。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，5 000pg/mL的TGF-β1可將活化的CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞[8]。本試驗(yàn)還觀察胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1分泌的TGF-β1的水平與Foxp3的表達(dá)存在關(guān)系，胰腺癌細(xì)胞CF-PAC1能夠顯著上調(diào)正常人PBMC中Foxp3蛋白的表達(dá)，而且該作用能被TGF-β1抗體所拮抗。本研究結(jié)果表明，胰腺癌細(xì)胞可分泌產(chǎn)生TGF-β1，從而促進(jìn)了PBMC中Foxp3蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步推斷胰腺癌細(xì)胞分泌的TGF-β1可促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化和自身增殖，可對機(jī)體的免疫功能起進(jìn)一步的抑制作用。

Moo-Young等[8]也發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)TGF-β1的胰腺癌細(xì)胞pan02可誘導(dǎo)小鼠大量CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+FOXP3+Treg細(xì)胞，而低表達(dá)TGF-β的胰腺癌細(xì)胞未觀察到此現(xiàn)象。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這些證據(jù)表明腫瘤來源的TGF-β1可促進(jìn)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的增殖，這也是腫瘤免疫抑制的重要機(jī)制之一。

綜上所述，可以通過TGF-β1對Foxp3的表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控，且進(jìn)一步調(diào)控Treg細(xì)胞的數(shù)目及功能活性，從而影響腫瘤免疫抑制功能的發(fā)揮。

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曹亞峰(1990-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事消化內(nèi)科研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.045

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1671-8348(2016)23-3290-03

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2016-03-24)