葛金蓮，唐 婧，羅德梅，孟存仁

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，烏魯木齊 830054)

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化學發(fā)光微粒子免疫分析在丙型肝炎診斷中的應用價值*

葛金蓮，唐 婧，羅德梅，孟存仁△

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，烏魯木齊 830054)

目的 研究化學發(fā)光微粒子免疫分析(CMIA)在丙型肝炎診斷中的應用價值。方法 收集2014年4月至2015年4月該院住院患者350例血清標本，依照臨床診斷分為丙型肝炎病例組(128例)和非丙型肝炎對照組(222例)，分別用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、CMIA、PCR-熒光探針法和重組免疫印跡法(RIBA)檢測，并對結果進行比較。結果 丙型肝炎病例組的ELISA,CMIA及PCR-熒光探針法檢測陽性率高于非丙型肝炎對照組，RIBA則較低。CMIA的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率和約登指數分別為95.3%、95.5%、92.4%、97.3%、95.4%和90.8%。CMIA與ELISA比較，CMIA的特異度、陽性預測值、符合率和約登指數比ELISA高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CMIA與PCR比較，CMIA的靈敏度、陰性預測值、符合率和約登指數比PCR-熒光探針法高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，特異度比PCR-熒光探針法低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CMIA與RIBA比較，CMIA的靈敏度、陰性預測值和約登指數比RIBA高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，特異度比RIBA低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 CMIA具有高的靈敏度和陰性預測值，較高的特異度和陽性預測值，符合率高，約登指數高且診斷價值高。

肝炎，丙型；分子探針；聚合酶鏈反應；酶聯免疫吸附測定；化學發(fā)光微粒子免疫分析；PCR-熒光探針法

丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌，對健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題[1]。目前，HCV感染的診斷方法主要是HCV抗體和HCV-RNA檢測。 其中HCV抗體的檢測方法主要是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、化學發(fā)光微粒子免疫分析(CMIA)和重組免疫印跡法(RIBA)。HCV-RNA檢測方法主要是PCR-熒光探針法。本試驗采用CMIA對350例血清標本進行檢測，并同時采用ELISA、PCR-熒光探針法和RIBA檢測，將結果進行比較分析，以研究CMIA在丙型肝炎檢測方面的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年4月至2015年4月本院住院患者350例。根據臨床診斷將其分為丙型肝炎病例組和非丙型肝炎對照組。其中丙型肝炎病例組128例，其中男68例，女60例；年齡1～78歲，平均年齡45歲。非丙型肝炎對照組222例，其中男100例，女122例；年齡3～80歲，平均年齡38歲。符合下列任何一項即可診斷為臨床診斷丙型肝炎病例：(1)符合血清丙型肝炎抗體陽性和流行病學史；(2)符合血清丙型肝炎抗體陽性和臨床表現；(3)符合血清丙型肝炎抗體陽性和血清丙氨酸氨基轉移酶和門冬氨酸氨基轉移酶升高。納入標準：(1)年齡1～78歲，性別不限；(2)符合丙型肝炎的診斷標準。排除標準：肝硬化；重疊乙型肝炎病毒(HBV)感染；自身免疫性肝炎。本研究對象為人血清，其遵循的程序符合本院倫理委員會的倫理認證。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器

1.2.1.1 ELISA TECAN加樣系統(tǒng)(瑞士帝肯公司)；FAME后處理系統(tǒng)(瑞士哈美頓公司)；HCV抗體診斷試劑盒：ELISA(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，批號：C20130406)。

1.2.1.2 CMIA ARCHITECT i2000全自動化學發(fā)光免疫分析儀(美國雅培貿易上海有限公司)；HCV抗體測定試劑盒：化學發(fā)光微粒子免疫檢測法(美國雅培貿易上海有限公司，批號：50368LI00)。

1.2.1.3 PCR-熒光探針法 ABI Prism 7300檢測儀(美國ABI公司)；HCV核酸定量檢測試劑盒：PCR-熒光探針法(中山大學達安基因股份有限公司，批號：2015002 )

1.2.1.4 RIBA 加樣槍(Eppendorf)；擺動搖床(上海智城)；HCV抗體確證試劑盒：RIBA(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，批號：RC20130101)。

1.2.2 檢測方法 (1)ELISA：本試劑盒采用間接法ELISA原理。在微孔條上預包被基因重組HCV結構和非結構區(qū)抗原，配以酶標記免疫球蛋白G(IgG)抗體及TMB顯色劑等其他試劑，檢測人血清或血漿中的HCV抗體。(2)CMIA：ARCHITECT人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原抗體聯合檢測是采用兩步法免疫檢測， 通過CMIA技術與靈活的檢測模式相結合，檢測人血清和血漿中的HIV p24抗原及HIV 1(M組和O組)/HIV-2抗體。(3)PCR-熒光探針法：本試劑盒利用吸附柱法提取血清/血漿樣本中的HCV-RNA；采用TaqMan熒光探針檢測技術結合PCR擴增法進行檢測，選擇HCV保守區(qū)域作為檢測靶基因，設計特異性的檢測引物和熒光檢測探針，探針5′標記為FAM熒光基團，3′BHQ1淬滅基團。同時檢測體系中含有內參對照品，內參對照品檢測的探針5′標記為VIC熒光基團。提取的RNA經逆轉錄為cDNA，利用實時熒光定量PCR檢測技術，通過PCR過程中熒光信號的變化和RNA標準品擴增的熒光信號值的變化，實現對樣本中的核酸進行定量檢測；通過檢測內參對照品擴增是否正常來監(jiān)測待測樣本的處理過程及檢測中是否存在PCR抑制反應，避免檢測的假陰性。(4)RIBA：本試劑盒采用RIBA法原理，在硝酸纖維素膜條上預包被HCV合成抗原、重組抗原(Core、NS3、NS4、NS5)及對照線蛋白。將血清或血漿樣品稀釋，硝酸纖維素膜條浸泡在其中，與其反應，加入酶標記的抗人IgG抗體，與其反應，溫育，如樣品中含有HCV特異性抗體，則會形成“抗原-抗體-酶標二抗”復合物，加入底物，與其反應，顯色，加入終止液，終止反應，判斷結果。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值用率表示，組間采用χ2檢驗，符合率和約登指數的差異比較用z檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

丙型肝炎病例組ELISA、CMIA及PCR-熒光探針法測陽性率高于非丙型肝炎對照組，RIBA則較低,見表1。CMIA與ELISA比較，CMIA的特異度、陽性預測值、符合率和約登指數比ELISA高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028、0.041、0.033、0.000)。CMIA與PCR-熒光探針法比較，CMIA的靈敏度、陰性預測值、符合率和約登指數比PCR-熒光探針法高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000、0.000、0.033、0.000)，特異度比PCR低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。CMIA與RIBA比較，CMIA的靈敏度、陰性預測值和約登指數比RIBA-熒光探針法高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001、0.003、0.000)，特異度比RIBA低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.049)，見表1、2。

表1 ELISA、CMIA、PCR和RIBA的檢測結果(n)

表2 CMIA和ELISA、PCR、RIBA檢測結果比較

3 討 論

丙型肝炎由HCV感染引起，全球每年有300～400萬人感染HCV，超過35萬人死于與HCV相關的肝臟疾病。全球約有1.7億 HCV感染者，其中約1.5億人為慢性丙型肝炎患者。我國的HCV慢性感染率居全球第3(3.2%)，僅次于埃及和巴基斯坦[2]。目前，臨床上檢測HCV感染的方法主要有血清學方法和分子生物學方法。分子生物學方法技術較為復雜且試劑費用較昂貴；而血清學技術操作簡單，費用也較低廉。因此，臨床上多采用血清學技術[3]。

本研究結果顯示，CMIA與ELISA比較，CMIA的特異度、陽性預測值、符合率和約登指數比ELISA高，表明CMIA檢測抗-HCV相對于ELISA誤診率較低，即假陽性率較低，準確度較高，其診斷價值較高。ELISA具有簡單、快速、方便的特點，但對灰區(qū)結果判讀的可靠性通常較差。ELISA試劑為篩檢試劑，存在一定數量的假陰性和假陽性結果[4-5]。湯巧等[3]研究表明CMIA法敏感性和特異性均高于ELISA，ELISA結果邊緣值較多，判斷結果較為困難，而CMIA干擾較小，特異性高，對HCV抗體的檢測更準確和靈敏。用ELISA法檢測血清中抗HCV的過程中，HCV抗體的檢測結果影響因素較多，易出現假陽性[6-8]，同時因敏感度不夠，可能出現假陰性[9]。CMIA法采用苯并熒蔥為發(fā)光底物，且洗滌液的特殊配方可有效排除其他因素的干擾，能高度敏感地檢測出HCV抗體。汪欣等[10]研究表明CMIA法檢測的靈敏度高于ELISA法,但經統(tǒng)計學比較,二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明目前ELISA法檢測抗HCV診斷試劑盒已較為成熟，同樣具有較高的靈敏度。

酶聯免疫HCV抗體檢測雖然簡便易行，但檢測局限，易將窗口期標本漏檢，而CMIA檢測的應用縮短了HCV感染診斷的窗口期，也使抗病毒治療的監(jiān)測成為可能。CMIA以微粒替代平板，增加了免疫承載反應表面和速度，粒子與液態(tài)中的分子的雙向運動代替了ELISA中液態(tài)分子的單項擴散。同時，由于微粒子的分離、洗滌均較平板方便，所以有利于提高自動化程度。在微粒子基礎上應用發(fā)光放大系統(tǒng)，使檢測敏感度得到進一步提高，理論上微粒子發(fā)光檢測的敏感度比ELISA提高數百至上千倍。綜上技術優(yōu)勢，CMIA較之ELISA在敏感性、準確性、重復性和自動化程度上均有提高[11]。

本研究結果顯示，CMIA與PCR比較，靈敏度、陰性預測值、符合率和約登指數比PCR高，特異度比PCR低，表明CMIA檢測抗-HCV相對于PCR漏診率較低，即假陰性率較低，準確度較高，其診斷價值較高，誤診率較高，即假陽性率較高。實時熒光定量PCR技術是實時監(jiān)測整個PCR進程，并且將熒光基團加入在PCR反應引物序列上。目前國外應用磁珠技術和TaqMan，實現了從核酸提取到結果分析的全自動化，其全自動化流程減少了來自氣溶膠的污染，因而定量檢測的效率和精密度有了明顯提高。但是國內尚未大規(guī)模應用，因其全套設備和試劑價格昂貴。實時熒光定量PCR技術的最低檢測限可達12～15 IU/mL，敏感性高于定性試驗。其線性范圍可達(4.3～6.9)×107IU/mL，并且可以檢出HCV所有基因型。由于HCV-RNA定量檢測無法反映HCV肝內復制情況，因此HCV-RNA檢測陰性結果并不能排除HCV感染。同時，檢測存在漏檢的可能，因此需要隨訪RNA陽性者[12]。

本研究結果顯示，CMIA與RIBA比較，靈敏度、陰性預測值和約登指數比RIBA高，特異度比RIBA低，表明CMIA檢測抗-HCV相對于RIBA漏診率較低，即假陰性率較低，其診斷價值較高，誤診率較高，即假陽性率較高。RIBA是HCV感染的確證試驗，主要解決ELISA中的假陽性問題。伴隨著檢測技術的提高，出現了第3代ELISA試劑，其敏感性和特異性均有較大的提高，對于抗-HCV強陽性者，RIBA并不能提供更多的有關HCV感染的信息，對于抗-HCV弱陽性者，RIBA可為陽性、不確定或陰性結果，對丙型肝炎的診斷沒有幫助。從費用和效益的角度考慮，臨床上診斷HCV感染，作ELISA即可，沒有必要再作RIBA確證試驗。RIBA也可應用于HCV血清型分型，但印跡法操作起來較為繁瑣，限制了其在臨床上的普遍應用[13]。RIBA的診斷試劑可降低假陽性反應，可降低陽性率達80%，因此丙型肝炎抗體陽性者需要補作RIBA確證試驗。

綜上所述，CMIA具有高的靈敏度和陰性預測值，較高的特異度和陽性預測值，符合率高，約登指數高且診斷價值高，更有助于HCV的協助診斷，具有廣泛臨床應用和推廣意義。有助于醫(yī)生對患者病情的掌握，是早期臨床診斷有效控制丙型肝炎發(fā)生的重要手段；同時也是安全輸血的需要，對保障臨床輸血和手術安全起到積極作用，可有效避免醫(yī)療糾紛[14]。

[1]柳麗娟，謝玉玲，戴振賢，等．丙型肝炎病毒抗體化學發(fā)光免疫檢測方法的建立及其臨床應用[J]．生物技術通訊，2014，25(1)：97-99．

[2]WHO.Hepatitis C[EB/OL].http://www.who.int/mediacentre/contacts/en.[2015-09-17].

[3]湯巧，吳文靜，夏永祥．化學發(fā)光法和酶聯免疫吸附法檢測丙型肝炎病毒抗體的比較分析[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2011，32(8)：834-835．

[4]王福生．ELISA和PCR法篩查無償獻血者結果的分析[J]．細胞與分子免疫學雜志，2010，26(4)：398．

[5]葉燕芹，許文龍．丙型肝炎病毒感染試驗室診斷進展[J]．標記免疫分析與臨床，2011，18(4)：286-288．

[6]馮秀河，朱峰，王鳳玲．酶聯免疫吸附試驗檢測假陽性結果分析[J]．中國誤診學雜志，2008，8(20)：4870-4871．

[7]高艷，陳志強，麥永平，等．3組國產ELISA抗-HCV初復檢試劑的檢測效果評價[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2010，31(7)：743-744．

[8]劉文玉．酶聯法檢測丙型肝炎病毒抗體陽性分析[J]．白求恩軍醫(yī)學院學報，2008，6(3)：178-179．

[9]李瑞蘭，李忠平，樊忠杰，等．HCV抗體檢測臨界值附近樣本傳播HCV風險的研究[J]．臨床輸血與檢驗，2008，10(1)：31-35．

[10]汪欣，吳旋，趙素萍，等．4種檢測HCV抗體方法的應用評價[J]．中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學專業(yè))，2012，14(29)：205-206．

[11]周德眾．化學發(fā)光微粒子免疫分析法與酶聯免疫吸附法檢測感染性疾病抗原抗體的比較[J]．中外健康文摘，2012，9(38)：236．

[12]毛遠麗，王晗，李伯安．HCV試驗室檢測方法與臨床應用[J]．傳染病信息，2012，25(2)：75-79．

[13]尹秀華．丙型肝炎檢測方法的研究進展[J]．醫(yī)學理論與實踐，2013，26(2)：171-173．

[14]高志峰，胡麗華，雒維．2種方法檢測患者血清中丙肝抗體的對比分析[J]．臨床血液學雜志(輸血與檢驗版)，2011，24(4)：456-457．

Application value of chemiluminescence microparticle immunoanalysis in the diagnosis of Hepatitis C*

GeJinlian,TangJing,LuoDemei,MengCunren△

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi，theXinjiangUygurAutonomousRegion830054,China)

Objective To research the application value of chemiluminescent microparticle immunoassay in the diagnosis of Hepatitis C.Methods From April 2014 to April 2015,we collected 350 cases of serum samples from the first affiliated hospital of Xinjiang medical university.According to the clinical diagnosis,the patients were divided into observation group (128 cases) and the control group(222 cases).Eenzyme linked immunosorbent assay (ELISA),chemiluminescence microparticle immunoanalysis (CMIA),PCR fluorescence probe method and recombinant immunoblotting (RIBA) detection were used in this experiment.Results The positive of RIBA in control group was higher than that of observation group,while other measures turned to be the opposite.The sensitivity,specificity,PV+,PV-,coincidence rat and Youden index of CMIA method were 95.3%,95.5%,92.4%,97.3%,95.4% and 90.8% respectively.The specificity,PV+,coincidence rate and Youden index of CMIA were higher than those of ELISA,and the difference was statistically significant (P<0.05).The sensitivity,PV-,coincidence rate and Youden index of CMIA were higher than those of PCR,and the difference was statistically significant (P<0.05).The specificity of CMIA was lower than that of PCR,and the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with RIBA,the sensitivity,PV- and Youden index were higher,and the difference was statistically significant (P<0.05);the specificity were lower,and the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Chemiluminescent microparticle immunoassay analysis has high sensitivity,negative predictive value,higher specificity and positive predictive value,high coincidence rate,Youden index,and diagnostic value.

Hepatitis C；molecular probes；polymerase chain reaction；enzyme-linked immunosorbent assay;chemiluminescent microparticle immunoassay;PCR-fluorescence probing

衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心專項課題(28-1-13)。 作者簡介：葛金蓮(1968-)，主管技師，本科，主要從事臨床免疫學檢驗研究?！?/p>

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.020

R446.9

A

1671-8348(2016)23-3226-03

2016-04-13

2016-06-26)