林智峰，賈 林，趙 丹，馬 莉，唐玉玲，楊 銳，楊曉萍△

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆石河子 832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832008)

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整合素連接激酶抑制劑QLT0267對TEMT過程中P38MAPK表達(dá)的影響*

林智峰1，賈 林2，趙 丹1，馬 莉2，唐玉玲2，楊 銳2，楊曉萍1△

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆石河子 832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832008)

目的 探討在高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)過程中，整合素連接激酶 (ILK) 抑制劑QLT0267對P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，分10組，每組給予不同濃度葡萄糖及QLT0267，干預(yù)48 h。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖情況，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)；隨后選取對照組、高糖組、DMSO組、QLT0267(IC50)組(使用QLT0267后，HK-2細(xì)胞數(shù)量減少一半所需的QLT0267藥物濃度)，免疫熒光法檢測各組ILK、P-P38MAPK的表達(dá)；Western blot 檢測各組ILK、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化-蛋白激酶B(P-AKT)、P-P38MAPK、P38MAPK、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)，觀察各組表達(dá)差異性，探討在TEMT過程中QLT0267對P38MAPK的影響。結(jié)果 30 mmol/L的葡萄糖干預(yù)48 h HK-2細(xì)胞增殖顯著，同時上調(diào)細(xì)胞中ILK、P-AKT、P-P38MAPK、α-SMA的表達(dá)；QLT0267在抑制HK-2細(xì)胞增殖的同時，可以通過下調(diào)ILK下游P-AKT的表達(dá)，阻止P38MAPK活化，進(jìn)而減少HK-2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，延緩TEMT進(jìn)程。 結(jié)論 QLT0267可能通過部分阻止P38MAPK的活化，從而延緩HK-2細(xì)胞TEMT進(jìn)程。

糖尿病腎?。唤诵」苌掀ぜ?xì)胞；轉(zhuǎn)分化；整合素連接激酶；P38絲裂原活化蛋白激酶；QLT0267

隨著病情進(jìn)展，糖尿病腎病終將發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)，而RIF是終末期腎臟病的主要病理基礎(chǔ)之一，危害性大，是近年來的研究熱點。報道證實，腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT)在RIF過程中起著重要的作用[1]。因此，探究TEMT過程的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的作用靶點，早干預(yù)，早治療，對延緩RIF病程進(jìn)展有著十分重要的意義。

眾所周知，整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族上游信號分子，在正常腎小管上皮細(xì)胞中不表達(dá)或僅少量表達(dá)， TEMT后表達(dá)增高，是信號傳導(dǎo)的重要樞紐[2]。P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)是MAPK家族成員之一，其活化在一定程度上可以加速TEMT的進(jìn)程[3]，然而，ILK是否通過P38MAPK信號途徑參與TEMT的病程進(jìn)展目前鮮有文獻(xiàn)報道，因此本研究擬用不同濃度ILK抑制劑QLT0267，旨在觀察QLT0267對P38MAPK表達(dá)的影響，探討在高糖誘導(dǎo)TEMT過程中ILK與P38MAPK的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2，上海通派公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)，DMEM(無糖)/F12培養(yǎng)基(Gibicol公司)，0.25%胰蛋白酶+乙二胺四乙酸(EDTA，Heclon公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Solarbio公司)，QLT0267、二甲基亞砜(DMSO，上海前塵生物科技有限公司，QLT0267溶劑)，兔抗人ILK抗體(Abcam公司)，兔抗人蛋白激酶B(AKT抗體)、兔抗人磷酸化-蛋白激酶B(P-AKT)抗體、兔抗人P38MAPK抗體、兔抗人P-P38MAPK抗體(Cell Signaling公司)，鼠抗人α-SMA抗體(Abcam公司)、多聚甲醛(博士德生物公司)、山羊血清(中杉金橋公司)。

1.1.2 主要儀器 xMark酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD公司)、顯微鏡(Olympus公司)，LSM 510META共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)，XR+凝膠成像儀(BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 購置HK-2細(xì)胞株，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，取第 2～7 代細(xì)胞用于試驗。分為10組：(1)對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)；(2)高糖組(30.0 mmol/L葡萄糖)；(3)DMSO組(30.0 mmol/L葡萄糖+與Q30組劑量相同的DMSO；(4)Q0.05組(30.0 mmol/L葡萄糖+0.05 μmol/L QLT0267)、(5)Q0.5組(30.0 mmol/L葡萄糖+0.50 μmol/L QLT0267)；(6)Q10組(30.0 mmol/L葡萄糖+10.00 μmol/L QLT0267)；(7)Q20組(30.0 mmol/L葡萄糖+20.00 μmol/L QLT0267)；(8)Q30組(30.0 mmol/L葡萄糖+30.00 μmol/L QLT0267)；(9)Q50組(30.0 mmol/L葡萄糖+50.00 μmol/L QLT0267)；(10)Q100組(30.0 mmol/L葡萄糖+100.00 μmol/L QLT0267)干預(yù)48 h。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 MTT法檢測HK-2細(xì)胞增殖 收集對數(shù)期HK-2細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)，次日同步化12 h，按上述分組加藥，每組6個復(fù)孔，干預(yù)48 h；換液后每孔加入100 μL完全培養(yǎng)液及20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀中低速振蕩3次，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔光密度(OD)值；試驗重復(fù)3次，并按以下公式計算抑制率，抑制率=[OD高糖組-ODQLT0267(IC50)組]/OD高糖組×100%，SPSS法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)[4]，選取QLT0267(IC50)組。

1.2.3 免疫熒光法檢測 取對數(shù)期細(xì)胞于6孔板中爬片，細(xì)胞數(shù)約8 000/張，按對照組、高糖組、DMSO組、QLT0267(IC50)組加藥干預(yù)48 h。4%多聚甲醛固定，10%山羊血清封閉30 min，滴加兔抗人單克隆ILK(1∶400)、P-AKT(1∶1 000)、P-P38MAPK(1∶800)抗體，4 ℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶100)室溫孵育1.5 h，封片，采圖，AIM examiner系統(tǒng)進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.2.4 Western blot檢測 取對數(shù)期細(xì)胞種板，按對照組、高糖組、DMSO組、QLT0267(IC50)組加藥，干預(yù)48 h后冰上裂解并收集細(xì)胞，12 000 r/min 4 ℃離心25 min，提取蛋白，蛋白質(zhì)定量試劑盒 (BCA 法)測蛋白濃度，配平后加入5×loading buffer煮沸，使蛋白變性，上樣電泳，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉或BSA室溫封閉2 h，兔抗人單克隆ILK、P-AKT、AKT、P-P38MAPK、P38MAPK 抗體(1∶1 000～1∶2 000)或鼠抗人單克隆α-SMA抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶20 000)室溫孵育2 h，暗室曝光，凝膠成像和Gel-Pro analyzer分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度QLT0267干預(yù)48h對HK-2細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比，高糖組、DMSO組、Q0.05組、Q0.5組HK-2細(xì)胞OD值增高(P<0.05)，Q10、Q20、Q30、Q50、Q100組HK-2細(xì)胞OD值降低(P<0.05)。與高糖組相比，DMSO組及濃度低于0.5μmol/L的QLT0267對細(xì)胞無顯著抑制作用(P>0.05)，Q10、Q20、Q30、Q50、Q100組細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率分別為23.8%、48.7%、65.0%、75.1%、84.9%(表1)。根據(jù)上述細(xì)胞增殖抑制率的情況，通過SPSS計算QLT0267 的IC50濃度(用QLT0267后活細(xì)胞數(shù)量增殖抑制率為50%的濃度)，約為24.5～32.1μmol/L，故依據(jù)前期試驗結(jié)果選取28μmol/L為QLT0267的IC50濃度，即為QLT0267(IC50)組。

表1 干預(yù)48 h后各組HK-2細(xì)胞OD值

圖1 激光共聚焦法、Western blot檢測HK-2細(xì)胞中ILK的表達(dá)(×200)

2.2QLT0267作用48h對HK-2細(xì)胞中ILK表達(dá)的影響 激光共聚焦法、Westernblot檢測各組中ILK表達(dá)情況顯示，對照組中ILK蛋白表達(dá)量較低，與對照組相比，高糖組、DMSO組、QLT0267(IC50)組ILK熒光強(qiáng)度顯著增高(F=12.382，P<0.05)，但3組間熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western印跡法結(jié)果與免疫熒光法結(jié)果一致(F=1 090.078， P<0.05)，見圖1、2。

2.3QLT0267干預(yù)48h對HK-2細(xì)胞中AKT、P-AKT表達(dá)的影響 對照組中P-AKT灰度值較低，且其蛋白表達(dá)量低于其余3組(F=16 979.843，P<0.05)；高糖組與DMSO組組間P-AKT灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與高糖組相比，QLT0267(IC50)組灰度值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩種方法檢測細(xì)胞蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=105.62，P<0.05)。各組間AKT灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.103，P>0.05)，見圖3、4。

圖2 Western blot檢測QLT0267干預(yù)48 h對HK-2細(xì)胞中ILK表達(dá)的影響

圖3 免疫熒光檢測HK-2細(xì)胞中P-AKT的表達(dá)(×200)

2.4QLT0267干預(yù)48h對HK-2細(xì)胞中P38MAPK、P-P38MAPK表達(dá)的影響 對照組中P-P38MAPK灰度值最低。與對照組相比，高糖組、DMSO組、QLT0267(IC50)組P-P38MAPK灰度值顯著增高(F=1 027.973，P<0.05)；與高糖組相比，DMSO組中P-P38MAPK蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，QLT0267(IC50)組中P-P38MAPK蛋白表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。各組間P38MAPK灰度值不隨藥物干預(yù)而變化(F=1.125，P>0.05)。免疫熒光法檢測細(xì)胞中P-P38MAPK表達(dá)，結(jié)果較前基本一致(F=40.885，P<0.05)，見圖5、6。

2.5QLT0267干預(yù)48h對HK-2細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的影響 對照組中α-SMA僅少量表達(dá)，與對照組相比，其余3組α-SMA表達(dá)均增高(F=1 051.225，P<0.05)。與高糖組相比，DMSO組不能顯著下調(diào)TEMT后HK-2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)(P>0.05)，QLT0267(IC50)組可以使α-SMA蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖7。

圖4 Western blot法檢測各組HK-2細(xì)胞中AKT、P-AKT表達(dá)

圖5 免疫熒光檢測HK-2細(xì)胞中P-P38MAPK的表達(dá)(×200)

圖6 Western blot檢測HK-2細(xì)胞中P38MAPK、P-P38MAPK的表達(dá)

圖7 Western blot 檢測HK-2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)

3 討 論

正常腎間質(zhì)中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生成與降解始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)，病理情況下，平衡遭到破獲，導(dǎo)致過量的ECM在腎間質(zhì)內(nèi)蓄積，最終引起RIF。研究表明TEMT與RIF關(guān)系密切，其嚴(yán)重程度與預(yù)后密切相關(guān)[4]，而表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)是TEMT開始的標(biāo)志[5]。本試驗證實，30mmol/L葡萄糖作用48h，可促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖，同時α-SMA表達(dá)增高，佐證轉(zhuǎn)分化模型成功。在此過程中ILK、P-P38MAPK表達(dá)均增高，而ILK作為MAPK家族上游蛋白，是否能夠通過活化的MAPK家族成員P38MAPK參與TEMT過程值得討論。

ILK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)連接處的重要分子骨架， 對ECM具有調(diào)控作用[6]，其特異性抑制劑QLT0267可以通過抑制ILK下游AKT磷酸化進(jìn)而發(fā)揮其抑制效果[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在抑制腫瘤細(xì)胞生長、降低糖尿病大鼠尿清蛋白/肌酐比值等過程中，QLT0267可通過上述途徑發(fā)揮治療作用[8-16]。同時，周媧等[10]也發(fā)現(xiàn)，多條信號通路參與了TEMT過程，TGF-β/ILK是其中之一，在該過程中ILK表達(dá)增高，與本試驗結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，QLT0267可以抑制ILK下游AKT活化進(jìn)而使α-SMA表達(dá)降低，延緩TEMT進(jìn)展。

p38MAPK表達(dá)于所有類型的細(xì)胞中，在控制細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等生理過程中起主要作用[11-12]。P38MAPK被磷酸化為P-P38MAPK而激活，進(jìn)而完成調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[13]。在TEMT過程中，P38MAPK通過保守的三級激酶級聯(lián)形式激活，抑制P38MAPK的磷酸化，改善糖尿病腎病中腎臟的炎性病變，延緩TEMT的進(jìn)程[14]。

目前已有報道納米材料可以激活I(lǐng)LK/p38MAPK通路，引起成骨細(xì)胞分化，證實P38MAPK是ILK下游的效應(yīng)分子[15]；同時，Smeeton等[16]也發(fā)現(xiàn)ILK可通過P38MAPK信號通路阻礙發(fā)育過程中輸尿管胚芽的生長。本研究通過免疫熒光法、Westernblot法證實，在TMET過程中，QLT0267可以通過下調(diào)P-AKT的表達(dá)，顯著抑制P38MAPK活化，而不改變P38MAPK總蛋白表達(dá)量，但其P-P38MAPK表達(dá)量仍高于對照組，提示多條信號途徑參與TEMT過程；ILK可能可以通過活化P38MAPK以外的其他信號途徑參與TEMT過程；QLT0267尚不能完全抑制ILK下游蛋白活化；ILK阻斷P38MAPK活化可能具有平臺效應(yīng)。與此同時，α-SMA表達(dá)亦減少，提示TEMT得到改善。

綜上所述，QLT0267可以通過特異性阻止ILK下游蛋白AKT的活化，有可能抑制部分的細(xì)胞增殖，下調(diào)高糖誘導(dǎo)TEMT過程中P-P38MAPK的表達(dá)，延緩DN過程中TEMT的進(jìn)程。

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The effect of QLT0267 which is inhibitor of ILK on P38MAPK in process of HK-2 cells TEMT*

LinZhifeng1,JiaLin2,ZhaoDan1,MaLi2,TangYuling2,YangRui2,YangXiaoping1△

(1.DivisionofNephrology,theFirstAffiliatedHospital,CollegeofMedicine,ShiheziUniversity，Shihezi,theXinjiangUygurAutonomousRegion832008,China；2.MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,theXinjiangUygurAutonomousRegion832008,China)

Objective To observe the effect of different concentrations of QLT0267 which is the inhibitor of integrin-linked kinase(ILK) on P38 mitogen activated protein kinase (P38MAPK),in process of high glucose-induced tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation (TEMT).Methods The cultured human renal tubular epithelial(HK-2) cell were divided into 10 groups by the different concentrations of GS and QLT0267,cultured 48 h.The inhibition ratio in each group was calculated by the method of MTT,and found concentration which inhibit rate was 50%(IC50).Then we selected control group,high-glucose group,DMSO group and QLT0267(IC50)group(The concentration of QLT0267,which led to the HK-2 cell reduced by half).The protein of ILK,AKT,P-AKT,P38MAPK,P-P38MAPK and α-smooth muscle actin (α-SMA) were detected by the method of immunofluorescence and Western blot.We observed the differences in each group and explored the relationship between ILK and P38MAPK in the process of TEMT.Results HK-2 cell proliferated significantly after 30 mmol/L glucose intervention for 48 h，and at the same time it upregulated the expression of ILK,P-AKT,P-P38MAPK,α-SMA.50% HK-2 cell inhibited at the concentration of 28 μmol/L QLT0267.It decreased both the expression of P-AKT which down-regulated the expression of ILK,and the expression of P-P38MAPK,thereby reducing the expression of α-SMA and delaying process of TEMT at the concentrations of 28 μmol/L QLT0267 in HK-2 cell.Conclusion 28 μmol/L QLT0267 might inhibit HK-2 cell TEMT by decreasing the expression of P38MAPK.

diabetic nephropathy;kidney tubules epithelial cells;epithelial-mesenchymaltransition;ILK;P-38MAPK;QLT0267

石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃基金資助項目(2013ZRKXYQ-YD16)。 作者簡介：林智峰(1981-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腎小管疾病研究?！?/p>

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.013

R692

A

1671-8348(2016)23-3206-04

2016-04-24

2016-07-24)