胡火軍，黃益玲，汪 雷，郭金滿(mǎn)，馬金陽(yáng)

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科,湖北宜昌 443003；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,湖北宜昌 443002)

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白藜蘆醇對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞自噬的影響*

胡火軍1，黃益玲2△，汪 雷1，郭金滿(mǎn)1，馬金陽(yáng)1

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科,湖北宜昌 443003；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,湖北宜昌 443002)

目的 研究白藜蘆醇對(duì)腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用及其可能的作用機(jī)制。方法 分別用不同濃度的白藜蘆醇處理腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞12、24、48 h后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)U87細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；電子顯微鏡觀(guān)察藥物處理后U87細(xì)胞自噬空泡的出現(xiàn)；逆轉(zhuǎn)錄PCR及Western blot分別檢測(cè)白藜蘆醇作用后自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3(LC-3)、抗Bax交互作用因子(Bif-1)mRNA及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇對(duì)U87細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增大。電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)未使用白藜蘆醇處理的細(xì)胞未出現(xiàn)自噬空泡，而白藜蘆醇處理過(guò)的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的自噬空泡。白藜蘆醇能劑量依賴(lài)性地增強(qiáng)自噬相關(guān)基因LC-3、Bif-1 mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)論 白藜蘆醇可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來(lái)抑制U87細(xì)胞增殖，LC-3、Bif-1基因表達(dá)上調(diào)是其誘導(dǎo)自噬的可能機(jī)制。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；自噬；白藜蘆醇；U87細(xì)胞

白藜蘆醇(resveratrol)是含有芪類(lèi)結(jié)構(gòu)的非黃酮類(lèi)多酚化合物，廣泛存在于葡萄、松樹(shù)、花生等天然植物或果實(shí)當(dāng)中,具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血小板聚集、保護(hù)心血管、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[1-2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞中的自噬活動(dòng)可以在一些治療因素作用下被激活,過(guò)度自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡可以殺滅腫瘤細(xì)胞[3-4]。白藜蘆醇能否通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為模型，探討白藜蘆醇對(duì)腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為白藜蘆醇的抗腫瘤作用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 白藜蘆醇購(gòu)自Sigma 公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibcobrl公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基和FBS購(gòu)自美國(guó)Gibcobrl公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Amresco公司；Trizol總RNA抽提試劑購(gòu)自Invitrogen公司；GeneRulerTM100 bp Plus DNA Ladders購(gòu)自Fermentas公司(試劑來(lái)源見(jiàn)文獻(xiàn)[5])，引物由Sigma公司合成；一抗Bax交互作用因子(Bax-interacting factor-1,Bif-1)、β-actin、二抗辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG抗體購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司；微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3-β(LC-3)購(gòu)自Cell Signal公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞為本室傳代保存，培養(yǎng)于5%CO2,37 ℃濕化孵箱中。培養(yǎng)基DMEM含10%胎牛血清(FBS)，0.1 U/L青霉素,0.1 g/L鏈霉素,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用[5]。

1.2.2 MTT法測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔2×104)，12 h后加入不同濃度的白藜蘆醇(0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，測(cè)定MTT-甲臜化合物在570 nm處的光密度(OD)值，按公式：相對(duì)抑制率=(1-試驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.2.3 電鏡觀(guān)察細(xì)胞自噬小泡 U87細(xì)胞接種于12孔板，細(xì)胞密度70.0%～80.0%時(shí)，各孔分別加入不同濃度白藜蘆醇處理12 h，收集各組細(xì)胞，800 g離心10 min，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞沉淀，2.5%戊二酸醛4 ℃固定過(guò)夜，0.5%四氧化鋨孵育30 min后，用含2.0%醋酸雙氧鈾的50.0%乙醇著色、脫水后，環(huán)氧樹(shù)脂812包埋，60 ℃聚合48 h，80 nm切片后枸椽酸鉛染色，采用JEOL100CX11透射電子顯微鏡觀(guān)察拍照。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3和Bif-1 mRNA的表達(dá) 收集經(jīng)白藜蘆醇處理的U87細(xì)胞，用Trizol按說(shuō)明書(shū)提取總RNA，nano drop測(cè)定RNA的水平，用逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo(dT)20引物合成cDNA第1鏈，合成條件為70 ℃ 5 min、37 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 10 min。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，所用引物，退火溫度(Tm)及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外拍照分析。

表1 自噬相關(guān)基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3和Bif-1蛋白的表達(dá) 按文獻(xiàn)[4]的方法，離心收獲細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液(臨用前加入各種蛋白酶抑制劑)提取蛋白，調(diào)整蛋白水平,加入等量2×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳加樣緩沖液，置95～100 ℃沸水中變性5 min，行SDS-PAGE垂直電泳,電轉(zhuǎn)膜，加50 g/L脂奶粉于4 ℃冷庫(kù)封閉過(guò)夜。 PBST洗膜后，分別加相應(yīng)一抗37 ℃孵育1 h，PBST洗膜；加相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，PBST洗膜，等量的電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液A和B混合后加至膜上1 min，最后X線(xiàn)片顯影。

2 結(jié) 果

2.1MTT法測(cè)定白藜蘆醇對(duì)U87細(xì)胞增殖的抑制作用 白藜蘆醇對(duì)U87細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨其濃度的增大而加強(qiáng)，與0μmol/L白藜蘆醇，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度白藜蘆醇作用12、24、48 h對(duì)U87細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞自噬的影響 自噬是以細(xì)胞質(zhì)空泡化為特征的依賴(lài)于溶酶體的一種降解途徑,在電子顯微鏡下可以觀(guān)察到自噬性空泡的出現(xiàn)。0μmol/L白藜蘆醇處理的U87細(xì)胞無(wú)明顯自噬空泡，經(jīng)25μmol/L白藜蘆醇處理12h的U87細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)自噬空泡，50μmol/L白藜蘆醇處理U87細(xì)胞后出現(xiàn)的自噬空泡更為明顯，見(jiàn)圖2。

2.3 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA的影響RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能增強(qiáng)自噬相關(guān)基因LC-3、Bif-1mRNA表達(dá)水平，并具有劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖3。

圖2 白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞自噬的電鏡改變

圖3 白藜蘆醇對(duì)自噬相關(guān)基因LC-3、Bif-1 mRNA表達(dá)的影響(RT-PCR)

2.4 白藜蘆醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白的影響Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇作用后可明顯升高LC3-Ⅱ水平，Bif-1的表達(dá)也逐漸升高，見(jiàn)圖4。

圖4 白藜蘆醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC-3、Bif-1表達(dá)的影響(Westerm blot)

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46%，具有侵襲性生長(zhǎng)的特征，手術(shù)不易完全切除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，積極研究有效的抗腦膠質(zhì)瘤藥物尤其必要[6]。從天然藥物中尋找能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物單體或前體化合物，是目前國(guó)內(nèi)外腫瘤治療藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。白藜蘆醇屬于非黃酮類(lèi)多酚化合物,近年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)乳腺癌、前列腺癌、肝癌、白血病、皮膚癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用[7]。白藜蘆醇抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制不盡相同，Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過(guò)PTEN/PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。李明新等[9]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其發(fā)生機(jī)制與線(xiàn)粒體膜電位破壞，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性增強(qiáng)及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因 (bcl-2)表達(dá)水平降低有關(guān)。

近年來(lái)，自噬性程序性細(xì)胞死亡吸引了越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注，有關(guān)自噬研究的文獻(xiàn)在最近幾年呈爆炸式增長(zhǎng)，自噬性程序性細(xì)胞死亡的研究可能會(huì)像細(xì)胞凋亡一樣成為近幾年科技領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[10-11]。細(xì)胞自噬在維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、發(fā)育中起著重要作用，自噬過(guò)度或自噬不足會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生[12]。

自噬性程序性細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量包裹著細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的空泡樣結(jié)構(gòu)，即自噬空泡，同時(shí)伴有溶酶體對(duì)空泡內(nèi)成分的降解。LC-3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細(xì)胞自噬泡膜的通用標(biāo)記物[13]。在自噬泡形成的早期階段,LC-3的主要形式是LC3-Ⅰ。在哺乳動(dòng)物E1泛素樣酶Atg7和E2泛素樣酶Atg3的催化下，LC3-Ⅰ與位于自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ的相對(duì)分子質(zhì)量為16×103，LC3-Ⅱ的相對(duì)分子質(zhì)量為14×103。LC3從LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變是自噬發(fā)生的標(biāo)志之一，LC3-Ⅱ的水平或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例通常與細(xì)胞中自噬空泡的數(shù)量呈正相關(guān)[14-15]。

Bif-1,又名EndophilinB1，屬于Endophilin蛋白家族，它首先在Bax的綁定蛋白中被發(fā)現(xiàn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，Bif-1介導(dǎo)Bax構(gòu)象變化，激活Bax促凋亡功能，調(diào)控細(xì)胞凋亡通路[16]；另一方面，Bif-1可通過(guò)UVRAG蛋白與Beclin-1結(jié)合，從而激活VPS34蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞自噬的發(fā)生[17-18]。

本研究用白藜蘆醇處理腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，電鏡下可見(jiàn)明顯的自噬空泡，且從mRNA及蛋白水平均檢測(cè)到自噬相關(guān)基因LC-3和Bif-1表達(dá)水平的上調(diào)，表明白藜蘆醇作用后可以引發(fā)自噬過(guò)程的發(fā)生，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬也是白藜蘆醇發(fā)揮腫瘤抑制作用的機(jī)制之一，有關(guān)白藜蘆醇誘導(dǎo)凋亡及引發(fā)自噬的相關(guān)關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

[1]RaederstorffD,KunzI,SchwagerJ.Resveratrol,fromexperimentaldatatonutritionalevidence:theemergenceofanewfoodingredient[J].AnnNYAcadSci,2013,1290(8):136-141.

[2]呂林林,許麗娜,彭金詠.抗腦膠質(zhì)瘤中藥的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2014,31(8):1024-1031.

[3]KanzawaT,GermanoIM,KomataT,etal.Roleofautophagyintemozolomide-inducedcytotoxicityformalignantgliomacells[J].CellDeathDiffer,2004,11(4):448-457.

[4]占貞貞,陳思,葉艷,等.自噬及自噬性細(xì)胞死亡抑制紫杉醇誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,42(2):123-127.

[5]黃益玲,黃利鳴,尤程程,等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑在天花粉蛋白誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡中的作用[J].中國(guó)婦幼保健,2011,26(7):5423-5425.

[6]黃強(qiáng)，董軍．王之敏主編神經(jīng)腫瘤學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：215．

[7]NakataR,TakahashiS,InoueH.Recentadvancesinthestudyonresveratrol[J].BiolPharmBull,2012,35(3):273-279.

[8]LiuYZ,WuK,HuangJ,etal.ThePTEN/PI3K/AktandWnt/β-cateninsignalingpathwaysareinvolvedintheinhibitoryeffectofresveratrolonhumancoloncancercellproliferation[J].IntJOncol,2014,45(1):104-112.

[9]李明新，李健，樊偉英．白藜蘆醇誘導(dǎo)人脈絡(luò)膜惡性黑色素瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J]．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29(12)：2566-2568．

[10]SharmaK,LeN,AlotaibiM,etal.Cytotoxicautophagyincancertherapy[J].IntJMolSci,2014,15(6):10034-10051.

[11]MeijerAJ,CodognoP.Regulationandroleofautophagyinmammaliancells[J].IntJBiochemCellBiol,2004,36(12):2445-2462.

[12]ShintaniT,KlionskyDJ.Autophagyinhealthanddisease:adouble-edgedsword[J].Science,2004,306(5698):990-995.

[13]KabeyaY,MizushimaN,UenoT,etal.LC3,amammalianhomologueofyeastApg8p,islocalizedinautophagosomemembranesafterprocessing[J].EMBOJ,2000,19(21):5720-5728.

[14]KabeyaY,MizushimaN,YamamotoA,etal.LC3,GABARAPandGATE16localizetoautophagosomalmembranedependingonform-Ⅱformation[J].JCellSci,2004,117(Pt13):2805-2812.

[15]夏立平,李凌云,費(fèi)喜峰,等.自噬參與6-羥基多巴胺誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元死亡的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(12):2649-2651.

[16]TakahashiY,KarbowskiM,YamaguchiH,etal.LossofBif-1suppressesBax/Bakconformationalchangeandmitochondrialapoptosis[J].MolCellBiol,2005,25(21):9369-9382.

[17]TakahashiY,CoppolaD,MatsushitaN,etal.Bif-1interactswithBeclin1throughUVRAGandregulatesautophagyandtumorigenesis[J].NatCellBiol,2007,9(10):1142-1151.

[18]TakahashiY,MeyerkordCL,WangHG.Bif-l/endophilinB1:acandidateforcreseentdrivingforceinautophagy[J].CellDeathDiffer,2009,16(7):947-955.

The effect of resveratrol on human glioma U87 cell autophagy*

HuHuojun1,HuangYiling2△，WangLei1,GuoJinman1，MaJinyang1

(1.DepartmentofNeurosurgery，theFirstClinicalHospitalofChinaThreeGorgesUniversity/CentralPeople′sHospitalofYichangCity，Yichang,Hubei443003,China;2.DepartmentofPathology,MedicalCollege，ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China)

Objective To study the autophagy induction effect of resveratrol(Res) on glioma U87 cells and to explore the possible mechanism.Methods Glioma cell line U87 was treated with different concentration of Res.Cell growth inhibition was detected by MTT assay.Electronic microscope was used to observe the typical autophagic vacuoles.RT-PCR and Western blot analysis were used to detect the mRNA and protein expression level of LC-3 and Bif-1 gene.Results With the increase of drug concentration and the prolongation of action time,the inhibition effect of Res on the growth of U87 cells was gradually increased.Electron microscopic examination showed that the control group did not appear autophagic vacuoles,but the experiment group showed obvious autophagic vacuoles.Res increased the expression of autophagy related gene LC-3 and Bif-1 in both mRNA and protein levels in a dose-dependent manner.Conclusion Resveratrol could inhibit the proliferation of U87 cells by inducing autophagic cell death;the up-expression of autophagy related gene LC-3 and Bif-1 might mediate this process.

glioma；autophagy；resveratrol；U87 cell

湖北省自然基金面上項(xiàng)目(2014CFB682)；宜昌市中心人民醫(yī)院科研發(fā)展基金項(xiàng)目(KFJ2011005)。 作者簡(jiǎn)介：胡火軍(1972-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事腦腫瘤方面研究?！?/p>

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.008

R739.4

A

1671-8348(2016)23-3190-03

2016-04-16

2016-06-24)