韓浩賢,王虹艷,曲 鵬,田云朋

(1.天津醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，天津 300070;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，大連 116027;3.天津市第一中心醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300070)

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NLRP3與NOD2受體激活對(duì)下游炎癥因子表達(dá)的影響*

韓浩賢1,王虹艷2△,曲 鵬2,田云朋3

(1.天津醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，天津 300070;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，大連 116027;3.天津市第一中心醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300070)

目的 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)受體被其特異性配體激活后對(duì)下游炎癥因子表達(dá)的影響。方法 實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組、TATP組、TMDP、TMDP+ATP組。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定白細(xì)胞介素(IL)-1β及IL-18的表達(dá)， 逆轉(zhuǎn)錄PCR測定NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)的表達(dá)情況。結(jié)果TMDP組、TATP組、TMDP+ATP組的IL-1β和IL-18水平均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且TMDP+ATP組水平增高更顯著。TMDP組、TATP組、TMDP+ATP組的NLRP3和Caspase-1表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且TMDP+ATP組水平增高更顯著(P<0.05)。結(jié)論NOD2的特異性配體胞壁酰二肽，NLRP3的特異性配體腺苷三磷酸單獨(dú)刺激THP-1后NLRP3及下游炎癥因子的表達(dá)很弱或無表達(dá)，聯(lián)合刺激后可顯著增強(qiáng)NLRP3及下游炎癥因子的表達(dá)，二者之間存在相互促進(jìn)及協(xié)同作用。

白細(xì)胞介素-18；白細(xì)胞介素-1β；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1；NLRP3

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，我國冠心病的發(fā)病率和病死率也逐年升高,并呈年輕化趨勢，造成冠狀動(dòng)脈狹窄或阻塞的最常見原因是動(dòng)脈粥樣硬化。近年研究表明，細(xì)胞膜表面的Toll樣受體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NIRP3)樣受體是介導(dǎo)先天免疫系統(tǒng)和動(dòng)脈粥樣硬化的橋梁[1]，目前核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)參與形成動(dòng)脈粥樣硬化的研究逐漸受到重視。Duewell等[2]研究證實(shí)NLRP3炎癥小體可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展 。白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素18(IL-18)等炎癥因子介導(dǎo)的免疫機(jī)制參與了冠心病動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期階段，促進(jìn)了微血栓的形成及不穩(wěn)定斑塊的破裂。胞質(zhì)受體NLRP3和NOD2恰是以此形式來啟動(dòng)機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)，從而在動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[3]。NOD2和NLRP3是先天免疫模式識(shí)別受體最具有代表性的2個(gè)成員，目前關(guān)于二者的特異性配體胞壁酰二肽(MDP) 、腺苷三磷酸(ATP)聯(lián)合刺激細(xì)胞后是否可以引起NLRP3及下游炎癥因子表達(dá)顯著增加的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在探討NLRP3與NOD2這兩個(gè)胞內(nèi)受體的激活對(duì)其下游炎癥因子表達(dá)的影響，以期為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 單核細(xì)胞株(THP-1)購自中科院上海生命科學(xué)研究院。

1.1.2 主要試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器 MDP(Sigma公司)；ATP(Sigma公司)；IL-1β、IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Bioscience 公司)；NLRP3抗體(100 μL，Sigma公司)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)抗體(100 μL，Sigma公司)；CO2孵箱(Thermo Forma,美國)；電泳儀(六一儀器廠，北京)；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)儀(Bio-Rad iQ5,美國)；倒置顯微鏡CK40-F200型(Olympus公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組：加入磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μL后放入孵箱恒溫孵育24 h；TMDP組：加入25 μL MDP，使其濃度至10 μmol/L，放入孵箱恒溫孵育24 h[5]；TATP組：加入256 μL ATP，使其濃度至100 μmol/L，放入孵箱恒溫孵育24 h[6]；TMDP+ATP組：加入25 μL MDP，使其濃度至10 μmol/L，放入孵箱恒溫孵育2 h進(jìn)行MDP的預(yù)處理，再加入256 μL ATP，使其濃度至100 μmol/L，最后再置孵箱恒溫孵育24 h。

1.2.2 用ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)物IL-1β及IL-18的水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm測定光密度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣本水平濃度。

1.2.3 單核細(xì)胞RNA提取及RT-PCR Trizol法提取細(xì)胞RNA，并進(jìn)行RNA水平的測定。PCR引物由天津賽爾生物技術(shù)有限公司合成(表1)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。運(yùn)用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：SYBR Green Mix(2x)10.0 μL；ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL；Primer 1(5 pmol/μL)1.0 μL；Primer 1(5 pmol/μL)1.0 μL；Primer 1(5 pmol/μL)1.0 μL；Primer 2(5 pmol/μL)1.0 μL；Template 0.5 μL；雙蒸水ddH2O 7.1 μL；每孔20.0 μL。熱循環(huán)：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 60 s；72 ℃ 40 s；40個(gè)循環(huán)。

表1 目的基因和內(nèi)參β-actin的引物序列

2 結(jié) 果

2.1MDP、ATP單獨(dú)刺激及聯(lián)合刺激THP-1后對(duì)IL-1β和IL-18表達(dá)的影響MDP、ATP及MDP+ATP對(duì)單核細(xì)胞株分泌IL-1β、IL-18的影響：MDP、ATP及MDP+ATP作用于單核細(xì)胞株24h后，上清液中IL-1β、IL-18的水平升高(P<0.05)，而TMDP+ATP組所致的IL-1β、IL-18水平與TMDP組、TATP組比較顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 MDP、ATP及MDP+ATP對(duì)單核細(xì)胞株分泌IL-1β、IL-18的影響

2.2RNA總電泳圖RNA提取濃度0.5～2.0μg/μL， OD260/OD2801.8～2.0，RNA提取純度可滿足本實(shí)驗(yàn)要求；所有標(biāo)本在凝膠電泳圖上均可見清晰28、18、5s3條帶，其中28s條帶的亮度達(dá)到18s亮度的兩倍以上，符合本實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

圖1 RNA總電泳圖

2.3MDP、ATP單獨(dú)刺激及聯(lián)合刺激THP-1后對(duì)NLRP3、Caspase-1mRNA表達(dá)的影響 所有標(biāo)本均重復(fù)檢測3次取均值，MDP、ATP及MDP+ATP均可增加單核細(xì)胞株NLRP3、Caspase-1mRNA的表達(dá)(P<0.05)，但TMDP+ATP組可以明顯增加上述炎癥因子的表達(dá)(P<0.05)，見表3、4。

表3 各組對(duì)單核細(xì)胞株NLRP3 mRNA的表達(dá)

表4 各組對(duì)單核細(xì)胞株Caspase-1 mRNA的表達(dá)的影響

3 討 論

研究表明ATP是NLRP3的特異性配體，無活性的NLRP3必須通過ATP聚合最終產(chǎn)生有活性的NLRP3來切割Caspase-1前體(Pro-caspase-1)并使其活化，活化后的Caspase-1再次切割I(lǐng)L-1β、IL-18等底物，誘發(fā)少量IL-1β和IL-18的成熟和泌出[4]。本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果與既往的研究結(jié)果相符[5-6]。特異性配體MDP與NOD2結(jié)合后可啟動(dòng)核因子κB(NF-κB)經(jīng)典信號(hào)通路，活化的NF-κB可增強(qiáng)NOD2的基因表達(dá)，彼此形成一個(gè)正反饋環(huán)路，增強(qiáng)了IL-1β、IL-18前體的轉(zhuǎn)錄，最終加快了促炎癥因子的產(chǎn)生和泌出，從而參與炎癥反應(yīng)，并具有調(diào)控炎癥反應(yīng)的功能[7-8]。有研究證實(shí)NOD2可通過激活NALP1最終致使Caspase-1活化，并分泌少量炎癥因子[9]。至此可知活化的NOD2和NLRP3均可以激活Caspase-1。由此猜想NOD2和NLRP3在產(chǎn)生IL-1β和IL-18的過程中也有一定的交互關(guān)系。本研究單獨(dú)MDP、ATP刺激單核細(xì)胞后，IL-1β、IL-18的水平比較微弱表達(dá)，但與空白對(duì)照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDP預(yù)處理后的單核細(xì)胞中加入ATP，ELISA測試后發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-18的水平顯著高于空白對(duì)照組，較二者單獨(dú)刺激后有明顯差異。但I(xiàn)L-1β差異較顯著，這可能與它自身特性有關(guān)，胞外的IL-1β與胞內(nèi)的核因子κB(NF-κB)、胞內(nèi)的NF-κB與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的NOD2構(gòu)成兩對(duì)正反饋環(huán)路，從而放大最初的炎癥信號(hào)，導(dǎo)致機(jī)體損傷及微循環(huán)障礙加重[10]。

由Real-timePCR結(jié)果猜想可能與以下因素有關(guān)：(1)采納的MDP預(yù)處理時(shí)間與NF-κB達(dá)到峰值的時(shí)間相符；(2)MDP所致NF-κB信號(hào)通路的活化，為大量炎癥前體基因的轉(zhuǎn)錄提供了前提條件。Caspase-1的活化不僅是ATP激活NLRP3的結(jié)果，而且是MDP激活NLRP1的結(jié)果，Caspase-1是二者聯(lián)合刺激后產(chǎn)生效應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)[11]；(3)MDP的預(yù)刺激既提供了大量無活性的NLRP3蛋白寡聚體又加強(qiáng)了NLRP3對(duì)ATP的敏感性，從而導(dǎo)致更多Caspase-1的自身激活[12];(4)MDP激活NOD2后促使正反饋環(huán)路形成，大量的NOD2憑借NLRP1這條途徑切割Pro-Caspase-1，誘發(fā)大量IL-1β、IL-18分泌到細(xì)胞外，而細(xì)胞外IL-1β的增多又促進(jìn)了其上游因子間正反饋環(huán)路的構(gòu)成。

綜上，MDP、ATP單獨(dú)刺激單核細(xì)胞后NLRP3及下游炎癥因子的表達(dá)很微弱，MDP聯(lián)合ATP刺激細(xì)胞后可促進(jìn)NLRP3及下游炎癥因子的表達(dá)顯著增加，二者之間存在促進(jìn)及協(xié)同作用，但產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的具體機(jī)制及信號(hào)途徑的具體位點(diǎn)尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究去證實(shí)。NLRP3及炎癥因子參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展，干預(yù)其下游因子及調(diào)控其信號(hào)通路將為治療動(dòng)脈粥樣硬化的形成提供新的方向。

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Affect of NLRP3 and NOD2 activated on the downstream inflammatory cytokines*

HanHaoxian1,WangHongyan2△,QuPeng2,TianYunPeng3

(1.theSchoolofNursing,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2.CardiovascularInternalMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian，Liaoning116027,China;3.CardiovascularInternalMedicine,theFirstCentralHospitalofTianjin，Tianjin300070,China)

Objective To explore the affect of NLRP3 and NOD2 activated on the downstream inflammatory cytokines.Methods The cases were divided into 4 groups:blank control group,TMDPgroup,TATPgroup and TMDP+ATPgroup.The expression of IL-1β and IL-18 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),and the expression of NLRP3 and Caspase-1 were tested by real-time PCR.Results The levels of IL-1β and IL-18 in TMDPgroup，TATPgroup and TMDP+ATPgroup were higher than that of blank control group(P<0.05),and the group of TMDP+ATPlevels increased more significantly(P<0.05).The expression of NLRP3 and Caspase-1 in TMDPgroup,TATPgroup and TMDP+ATPgroup were higher than that of blank control group(P<0.05)，and the levels of TMDP+ATPgroup increased more significantly(P<0.05).Conclusion The expression of NLRP3 and downstream inflammatory factors are weak or no expressions occur when MDP (specific ligand of NOD2) and ATP (specific ligand of NOD2) independently stimulate THP-1.However,the expression is enhanced significantly after the joint stimulation,which means that MDP and ATP have synergistic and promoting relationship.

IL-18；IL-1β;Caspase-1；NLRP3

遼寧省自然科學(xué)基金(2013023025) 。 作者簡介：韓浩賢(1983-)，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事心血管病方面研究。△

E-mail：hongyanwang1967@aliyun.com。

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.005

R

A

1671-8348(2016)23-3182-03

2016-04-01

2016-06-23)