惠 雙，郭宏強(qiáng)，王 博，王 媛，張成輝

(1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 473000;2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,鄭州 450000)

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雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞自噬活性的影響及機(jī)制研究*

惠 雙1，郭宏強(qiáng)2，王 博1，王 媛1，張成輝1

(1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 473000;2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,鄭州 450000)

目的 探討雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞自噬活性的影響及機(jī)制。方法 采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制率、半數(shù)抑制濃度(IC50)；免疫熒光化學(xué)法測(cè)定細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)，Westernblot法測(cè)定LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、磷酸化P70、磷酸化Erk、磷酸化AKT蛋白的表達(dá)。結(jié)果 雷公藤甲素作用于U251細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受抑制，24h的IC50為0.73μmol/L，48h的IC50為0.27μmol/L。免疫熒光法測(cè)定6、12、24h后LC3-Ⅱ水平增高；Westernblot法測(cè)定LC3-Ⅱ水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值隨時(shí)間增高；Beclin-1水平增高，磷酸化P70、磷酸化Erk表達(dá)降低、磷酸化AKT無明顯變化。結(jié)論 雷公藤甲素可抑制U251細(xì)胞增殖并促進(jìn)自噬，并可通過上調(diào)Beclin-1表達(dá)和抑制mTOR的活性來促進(jìn)自噬。

雷公藤內(nèi)酯；自噬；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；U251細(xì)胞

膠質(zhì)瘤是源于神經(jīng)外胚層間質(zhì)細(xì)胞的顱內(nèi)惡性腫瘤，約占顱腦腫瘤的50%。其中多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是較常見的一種病理類型，標(biāo)準(zhǔn)治療為手術(shù)和術(shù)后放射治療。其惡性程度高，治療效果差，接受標(biāo)準(zhǔn)治療患者的中位生存期僅為9個(gè)月[1]。近年來，對(duì)該病治療進(jìn)展主要在替莫唑胺同步放化療并聯(lián)合化療或靶向治療，但仍未能明顯提高其療效[2]。因此，尋求有效的治療藥物對(duì)于多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療有著重要意義。雷公藤甲素是中藥材雷公藤的一種提取成分，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗生育等多種作用[3-6]。有文獻(xiàn)表明雷公藤甲素可影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期調(diào)控和促進(jìn)凋亡[7-8]。雷公藤甲素作用于多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞增殖，本研究初步研究其發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 U251細(xì)胞系由鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品由福建漢堂生物制藥公司提供；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、免疫熒光試劑盒、細(xì)胞總蛋白提取試劑盒為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；鼠抗人單克隆抗體、兔抗鼠酶標(biāo)二抗為上海碧云天生物公司產(chǎn)品；PE標(biāo)記單抗、流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ型)為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)比色儀:Metertech.∑960型，蛋白電泳儀:A131154型。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)選用含有10%滅活小牛血清，青霉素和鏈霉素各100 KU/L的RPMI-1640培養(yǎng)液，將U251細(xì)胞加入該培養(yǎng)液置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)懸浮培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制的檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞以3×108/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，加入終濃度為0、0.01、0.10、0.30、0.50 μmol/L的雷公藤甲素，對(duì)照組加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)液，各孵育60 h。每12 h收集各組U251細(xì)胞，使用MTT法在ELISA比色儀570 nm處記錄吸光度(A)值,并計(jì)算出不同濃度組雷公藤甲素在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)。每濃度組設(shè)5個(gè)平行副孔測(cè)均值。增殖抑制率=(對(duì)照孔A值-各濃度孔A值)/對(duì)照孔A值×100%，IC50由線性回歸方程求得。

1.2.3 免疫熒光法測(cè)定U251細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá) 將加入0.20 μmol/L雷公藤甲素培養(yǎng)的U251細(xì)胞組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，加入等量生理鹽水的U251細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。培養(yǎng)6、12、24 h后收集各組細(xì)胞，上離心機(jī)以3 000 r/min 分離細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后于多聚賴氨酸玻片上進(jìn)行細(xì)胞涂片；使用4%多聚甲醛固定30 min后，用PBS洗滌3次后晾干。置于37 ℃用山羊血清封閉20 min，加入鼠抗人LC3-Ⅱ一抗置4 ℃冰箱過夜。再次用PBS洗滌3次后，加入熒光素標(biāo)記兔抗鼠二抗，置于37 ℃孵育15 min后，封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.2.4 Western blot法測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 分組及培養(yǎng)方法同免疫熒光法。各組收集細(xì)胞2×107，用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒，裂解細(xì)胞，4 ℃離心機(jī)以12 000 g分離蛋白。加入PBS液煮沸5 min后上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，用2%牛血清清蛋白-磷酸鹽緩沖液(BSA-PBS)封閉過夜，次日加鼠抗人單抗于37 ℃孵育4 h，PBS依次沖洗3次，加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗置37 ℃孵育1 h，PBS再次沖洗3次，加電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液顯色，置暗室曝光顯影，用圖像分析軟件記錄圖片數(shù)據(jù)帶灰度分析,用該法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、磷酸化P70、磷酸化Erk、磷酸化AKT蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制 不同濃度雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞均存在增殖抑制作用，見表1、圖1。24、48h的雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞的IC50為0.73μmol/L和0.27μmol/L。

圖1 不同濃度雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞增殖抑制率曲線

表1 不同濃度雷公藤甲素對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制作用

圖2 免疫熒光法測(cè)定U251細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)

圖3 Western blot法測(cè)定LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)

2.2 免疫熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞置于熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)中LC3-Ⅱ熒光信號(hào)極低且隨時(shí)間無明顯變化，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)LC3-Ⅱ熒光信號(hào)隨時(shí)間而明顯增強(qiáng)，見圖2。

2.3Westernblot法測(cè)定LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá) 隨時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也逐漸增高。對(duì)照組LC3-Ⅱ表達(dá)較低，隨時(shí)間無明顯變化，見圖3。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在6、12、24h后，LC3-Ⅰ相對(duì)表達(dá)度、LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)度、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4Westernblot法測(cè)定Beclin-1、磷酸化P70、磷酸化Erk、磷酸化AKT蛋白的表達(dá) 用Westernblot法測(cè)定第24h的實(shí)驗(yàn)及對(duì)照組各蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組Beclin-1組較對(duì)照組明顯增高，而實(shí)驗(yàn)組磷酸化P70、磷酸化Erk較對(duì)照組明顯降低，磷酸化AKT兩組無明顯差異，見圖4。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，Beclin-1、磷酸化P70、磷酸化Erk蛋白相對(duì)表達(dá)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，磷酸化-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 Western blot法測(cè)定Beclin-1、磷酸化-P70、磷酸化-Erk、磷酸化-AKT蛋白的表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)溶酶體依賴性的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器降解過程，是細(xì)胞應(yīng)激的一種表現(xiàn)。自噬與腫瘤的增殖調(diào)控，能量代謝，凋亡調(diào)控，免疫逃逸，轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)，微環(huán)境改變等諸多生物學(xué)行為密切相關(guān)[9-13]，研究腫瘤細(xì)胞的自噬屬性對(duì)于腫瘤的防治有著重要的意義。

微管相關(guān)輕鏈蛋白3 (LC3)在自噬體的輸送和與溶酶體的融合過程起重要作用，其活性體LC3-Ⅱ定位于自噬體外膜，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是反映自噬強(qiáng)度的一個(gè)重要指標(biāo)[13-14]。Beclin-1在自噬體隔膜隔離和囊泡封閉過程中起重要作用，其可與P53蛋白、B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白家族等多種蛋白相互作用而影響自噬[15]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)樞紐，活化型mTOR復(fù)合體通過抑制ULK1-FIP200-Atg13復(fù)合體激活從而抑制自噬，P70是mTOR一個(gè)重要底物，實(shí)驗(yàn)常以P70數(shù)量反映mTOR活性[9,16]，Ras/MAPK/Erk/mTOR通路和PI3KI/AKT/mTOR通路是mTOR上游2個(gè)重要通路，由多種生長(zhǎng)因子信號(hào)介導(dǎo)，通過激活mTOR實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的抑制[16-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可誘導(dǎo)U251細(xì)胞自噬而抑制其生長(zhǎng)，并明確了此作用的部分機(jī)制：(1)增強(qiáng)Beclin-1表達(dá)；(2)下調(diào)Erk表達(dá)，從Ras/MAPK/Erk/mTOR通路抑制mTOR活性。

本研究為臨床應(yīng)用雷公藤甲素治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。雷公藤甲素誘導(dǎo)U251細(xì)胞自噬的其他機(jī)制，本課題組正在研究中并將陸續(xù)發(fā)表研究成果。

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The influence and mechanism of Triptolide on autophagy in human glioma cell line U251*

HuiShuang1,GuoHongqiang2,WangBo1,WangYuan1,ZhangChenghui1

(1.DepartmentofOncology,CentralHospitalofNanyangCity,Nanyang,Henan473000,China;2.DepartmentofOncology,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China)

Objective To explore the variation of autophagic activity in U251 cells after treatment with Triptolide and its mechanisms.Methods We measured the proliferation inhibition rate,half inhibitory concentration (IC50) by MTT assay;LC3-Ⅱ protein expression were tested by immunofluorescence assay;protein expression of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,Beclin-1,Phospho-P70,Phospho-Erk and Phospho-AKT were measures by Western blot.Results After treatment with Triptolide,the proliferation of U251 cells was inhibited,with theIC50of 0.73 μmol/L at 24 h and theIC50of 0.27 μmol/L at 48 h;the expression of LC3-Ⅱ were increased at 6,12,24 h;the expression of LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Beclin-1 increased,the expression of Phospho-P70 and Phospho-Erk decreased and the expression of Phospho-AKT had no obvious change.Conclusion Triptolide could inhibit the proliferation of U251 cells and induce cell autophagy;Triptolide could increase the autophagy by upregulating Beclin-1 expression and inhibiting the activity of mTOR.

Triptolide；autophagy；glioblastoma；U251 cells

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81101797)。 作者簡(jiǎn)介：惠雙(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤的內(nèi)科治療及腫瘤的分子病理學(xué)方面研究。

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.004

R

A

1671-8348(2016)23-3179-03

2016-04-16

2016-06-21)