郭 帥，高艷平，趙亞影，周恩旭，付 麗，高慧茹，任元靜，趙安芳△

(1.河南省平頂山市第二人民醫(yī)院普外科 467000；2.河南省駐馬店市環(huán)境監(jiān)測站 463000；3.河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山 467036)

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·論 著·

鵝去氧膽酸誘導HCT-116細胞凋亡及其作用機制研究*

郭 帥1，高艷平2，趙亞影3，周恩旭3，付 麗3，高慧茹3，任元靜3，趙安芳3△

(1.河南省平頂山市第二人民醫(yī)院普外科 467000；2.河南省駐馬店市環(huán)境監(jiān)測站 463000；3.河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山 467036)

目的 研究鵝去氧膽酸(CDCA)對結腸癌細胞HCT-116的影響，并探討其作用機制。方法 采用體外細胞培養(yǎng)、四甲基偶氮唑藍(MTT法)、蘇木素-伊紅染色(HE染色)、吉姆薩染色(Giemsa染色)、吖啶橙/溴化乙錠染色(AO/EB染色)和流式細胞術檢測經(jīng)CDCA誘導處理對結腸癌HCT-116細胞的存活率、形態(tài)學變化、細胞周期、線粒體膜電位和細胞凋亡率的影響。結果 試驗結果表明，CDCA作用于結腸癌細胞HCT-116細胞株48 h的半抑制濃度為0.304 mmol/L。0.800 mmol/L CDCA處理48 h后細胞抑制率達88.4%，且表現(xiàn)出細胞體積縮小、細胞核固縮和染色質凝聚等凋亡特征性的形態(tài)學改變。流式細胞儀檢測結果顯示，經(jīng)CDCA誘導處理后，細胞株細胞周期被阻滯于G2/M期，線粒體膜電位降低，0.400 mmol/L CDCA處理48 h后HCT-116細胞凋亡率達54.5%。結論 CDCA對人結腸癌HCT116細胞株的抑制作用與其劑量有依賴性，并可能通過線粒體途徑誘導人結腸癌細胞HCT-116細胞株凋亡。

鵝脫氧膽酸；結腸腫瘤；細胞凋亡；細胞

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是人類高發(fā)消化道惡性腫瘤，近些年在我國部分地區(qū)發(fā)病率呈明顯上升趨勢，部分城市低齡化明顯，但其發(fā)病機制仍不明[1]。因此，尋找有效治療CRC的靶向藥物和方法成為了全球抗腫瘤研究的一個重要課題。鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)別名為3α′7α-二羥基-5-β-膽烷酸，為無色針狀結晶，無臭，味苦，是目前世界上用量最大的治療膽結石藥物之一，又是合成熊去氧膽酸和其他甾體化合物的原料，由膽汁提取而來[2-3]。CDCA具有降低膽汁內膽固醇飽和度，抗菌消炎和止咳平喘等多種藥理學作用[4]。近年來國外合成了CDCA衍生物用于膽結石的治療，細胞凋亡的誘導和抗腫瘤等方面的研究，但對于CDCA的作用機制尤其是抗腫瘤作用的機制尚未闡明[5]。因此，本研究對CDCA誘導處理結腸癌細胞HCT-116細胞凋亡及其作用機制進行研究，旨在為CDCA的抗腫瘤研究提供更加科學、客觀的依據(jù)和方法，并為相關疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株HCT-116細胞，購自中科院上海細胞庫。四甲基偶氮唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素雙抗，蘇木素、伊紅染液購自江蘇碧云天公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技有限公司；其他試劑均購自洛陽市化學試劑廠(國產(chǎn)AR級)。CO2細胞培養(yǎng)箱(型號3111)購自美國賽默飛世爾科技公司；流式細胞儀(Guava easyCyte 6-2L)和超純水儀(Milli-Q Reference)購自美國Millipore公司；熒光顯微鏡(ZYF-600)購自上海兆儀有限公司；酶聯(lián)免疫反應檢測儀(EnSpire)購自美國Perkin Elmer儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和誘導處理 HCT-116細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中(內含12%熱滅活胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗，pH7.2)，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。處理組細胞為HCT-116細胞培養(yǎng)24 h后進行CDCA誘導處理，對照組細胞則不加藥物處理。

1.2.2 MTT法 檢測細胞毒性并篩選藥物合適濃度 MTT試驗方法同文獻[6]。CDCA的濃度設計為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mmol/L。經(jīng)SPSS13.0軟件處理計算CDCA對HCT-116細胞的半抑制濃度(或稱半抑制率)，即IC50值。

1.2.3 蘇木素-伊紅染色(HE染色) 對照組和處理組細胞( 0.3 mmol/L CDCA)培養(yǎng)48 h后，取出長有細胞的蓋玻片用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次洗1 min。95%乙醇固定20 min，溫PBS漂洗3次，每次1 min。蘇木素染色10 min，自來水洗3 min。在1%的氨水中堿化5 min，自來水洗2次，每次2 min。超純水洗2次，每次1 min。1%的伊紅中染色5 min，95%乙醇中洗5 min，無水乙醇中浸泡10 min，在等量乙醇和二甲苯中置3 min。轉移至二甲苯中透明2次，每次5 min。中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 吉姆薩染色(Giemsa染色) 對照組和處理組細胞(0.3 mmol/L CDCA)培養(yǎng)48 h后，取出長有細胞的蓋玻片，用PBS漂洗3次，每次1 min。95%乙醇固定20 min，溫PBS漂洗3次，每次1 min。Giemsa染液染色10～30 min，超純水洗,搖床脫色1～10 min(視情況而定)。90%甘油封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色(AO/EB染色) 對照組和處理組細胞(0.3 mmol/L CDCA)培養(yǎng)48 h后，取出長有細胞的蓋玻片，PBS漂洗3次，每次1 min。加1～2滴AO/EB工作液，滴加時避光，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 流式細胞儀的相關檢測

1.2.6.1 PI單染法測細胞周期 流式細胞儀測細胞周期試驗方法參考文獻[6]。CDCA處理濃度為0、0.2和0.4 mmol/L。

1.2.6.2 線粒體膜電位的檢測 應用流式細胞儀檢測脫氧膽酸對HCT-116細胞線粒體膜電位的影響，Rhodamine123熒光強度值反映的是線粒體膜電位的高低。試驗方法參考文獻[7]，誘導處理組細胞為0.2、0.3和0.4 mmol/L CDCA，流式細胞儀檢測。

1.2.6.3 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 收集對照組和不同濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L)CDCA處理48 h的HCT-116細胞，加入195 μL AnnexinV-FITC結合液重懸細胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC，室溫避光孵育10 min。離心后加入190 μL AnnexinV-FITC結合液重懸細胞，再加入10 μL PI染色液，過200目濾網(wǎng)后進行流式細胞儀(guava easyCyteTM4200-0140)檢測。其中，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2 結 果

2.1CDCA顯著抑制HCT116細胞的生長和增殖MTT法檢測結果顯示，CDCA對人CRCHCT-116細胞的生長有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖1。經(jīng)CDCA處理48h后，HCT-116細胞抑制率由15.3%上升到88.4%。對試驗數(shù)據(jù)進行處理，可得到CDCA處理48h的IC50為0.304mmol/L。

圖1 CDCA對HCT-116細胞的抑制作用

2.2CDCA處理后HCT-116細胞的形態(tài)學變化HE和Giemsa染色結果顯示，經(jīng)0.3mmol/LCDCA處理48h后，HCT-116細胞表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)：細胞數(shù)量明顯減少，細胞體積變小，細胞核固縮和染色質凝聚(圖2B、D)。AO/EB染色結果顯示，細胞核著綠色呈固縮狀或圓珠狀的為早期凋亡細胞，核染色質為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀為晚期凋亡細胞。結果表明，CDCA處理后HCT-116細胞表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)特征(圖2F)。

2.3CDCA對HCT-116細胞周期的影響CRCHCT-116細胞經(jīng)0.2、0.4mmol/L的CDCA作用48h后，HCT-116細胞在各時相的分布發(fā)生了顯著的變化，見表1。其中，G2/M期細胞比例增加(P<0.05)，S期細胞比例明顯減少(P<0.05)，見圖3。

2.4CDCA對HCT-116細胞線粒體膜電位的影響 檢測結果顯示，隨著CDCA濃度的增加，綠色熒光強度降低；隨著CDCA處理濃度的增加，細胞的熒光峰逐漸向左移動，線粒體吸附Rhodamine123的能力下降，熒光強度逐漸減弱，細胞線粒體膜電位出現(xiàn)降低和崩塌，見圖4。

2.5CDCA對HCT-116細胞凋亡的影響 應用流式細胞儀檢測脫氧膽酸對BGC-823細胞凋亡率的影響發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內，隨著濃度的升高，細胞凋亡率逐漸升高，其中在0.4mmol/L的CDCA作用下細胞凋亡率達到54.50%，早期凋亡率達到27.52%(P<0.05)，見表2、圖5。

圖4 流式細胞術檢測線粒體膜電位

圖5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

3 討 論

細胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中具有重要作用，目前誘導腫瘤細胞的凋亡成為腫瘤治療研究中的一個主要目標與常用手段[8]。本試驗選用結腸癌HCT-116細胞為試驗材料，研究了CDCA對HCT-116細胞的增殖抑制作用及誘導其凋亡的作用。本研究證實了CDCA能夠有效地抑制結腸癌HCT-116細胞的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。這也同前人用其他藥物作用于結腸癌細胞的結果一致[9-11]。同時，形態(tài)學檢測也表明CDCA可誘導HCT-116細胞產(chǎn)生明顯的凋亡現(xiàn)象。

凋亡的早期表現(xiàn)是線粒體膜電位的降低。經(jīng)CDCA誘導處理后的HCT-116細胞線粒體膜電位降低，且隨著藥物濃度的升高，低熒光強度細胞所占比例越來越多。提示CDCA可能具有通過線粒體途徑誘導HCT-116細胞凋亡的生物學效應。此外，流式細胞術檢測細胞凋亡率的結果表明CDCA誘導HCT-116細胞凋亡具有濃度依賴性。

細胞周期的調控是抑制腫瘤細胞生長的一個有效的方法，許多抗癌藥物將細胞周期阻滯在G2/M期[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CDCA能夠有效地把HCT-116細胞阻滯在G2/M期，并可能通過線粒體途徑誘導HCT-116細胞凋亡，說明CDCA可通過抑制HCT-116細胞的周期進程從而抑制腫瘤細胞的生長增殖，而對于具體凋亡機制的確定還需要更進一步的研究和探討。因此，深入探索脫氧膽酸誘導人結腸癌HCT-116 細胞凋亡的機制，對于進一步研究人結腸癌細胞凋亡發(fā)生的機制及抗腫瘤的研究具有非常重要的指導意義和實際應用意義。

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The effect and mechanism of apoptosis induced by chenodeoxycholic acid in human colon cancer HCT-116 cells*

GuoShuai1，GaoYanping2，ZhaoYaying3，ZhouEnxu3，F(xiàn)uLi3，GaoHuiru3，RenYuanjing3，ZhaoAnfang3△

(1.DepartmentofGeneral，theSecondPeople′sHospitalofPingdingshanCity,Pingdingshan,Henan467000，China；2.ZhumadianEnvironmentalMonitoringStation,Zhumadian,Henan463000，China；3.SchoolofLifeSciencesandEngineering，HenanUniversityofUrbanConstruction,Pingdingshan,Henan467036,China)

Objective To evaluate the effects of chenodeoxycholic acid (CDCA) on human colon cancer cell line and to explore its mechanisms.Methods We used cell culture,MTT assay,HE staining,Giemsa staining,AO/EB staining and flow cytometry to detect cell survival rate,morphological changes,cell cycle,mitochondrial membrane potential and cell apoptosis rate of HCT116 cells after CDCA treated.Results HCT-116 cells were treated with CDCA for 48 h and itsIC50was 0.304 mmol/L;the inhibition rate of 88.4% was achieved when the concentration was 0.800 mmol/L,showing nuclear chromatin concentration and fragmentation as well as cell shrinkage and other morphological changes characteristic of apoptosis;CDCA arrested cell cycle at G2/M phase and induced mitochondrial membrane potential low.After treated with CDCA(0.400 mmol/L) for 48 h,cell apoptosis rate was 54.5%.Conclusion CDCA significantly inhibits the growth of HCT-116 cells in a dose-dependent manner and arrested cell cycle at G2/M phase,which indicates apoptosis of HCT-116 cells could be induced by CDCA via the mitochondrial-dependent pathway.

chenodeoxycholic acid；colonic neoplasms；apoptosis；cells

國家自然科學基金項目(81402309)；河南省科技攻關項目(132102310118，142102310120)；河南省教育廳科學技術研究重點項目(13A180044)。 作者簡介：郭帥(1978-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事普外科方面研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.001

R36；Q291

A

1671-8348(2016)23-3169-04

2016-04-08

2016-06-21)