肖芳，黃勤挽，易佳佳

·炮制制劑·

百藥煎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

肖芳，黃勤挽*，易佳佳

目的：建立百藥煎的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：以沒食子酸為對(duì)照品進(jìn)行百藥煎的薄層鑒別; 采用HPLC法測定百藥煎中沒食子酸的含量。對(duì)百藥煎水分、總灰分、酸不溶性灰分、黃曲霉毒素及顯微特征進(jìn)行檢測。結(jié)果：百藥煎的顯微特征性強(qiáng)；薄層色譜分離度好，斑點(diǎn)清晰。根據(jù)7批百藥煎樣品測定結(jié)果，建議百藥煎水分不得超過11.0%，總灰分不得超過4.0%，酸不溶性灰分不得超過1.0%；沒食子酸的進(jìn)樣量在0.24～0.64 μg（r＝0.9999）其峰面積積分值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.43%，RSD為0.79%，沒食子酸含量不得低于33.0%。結(jié)論：所建方法操作簡單，準(zhǔn)確可靠，可用于評(píng)價(jià)百藥煎的質(zhì)量。

百藥煎；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層鑒別；含量測定；沒食子酸

百藥煎為五倍子、茶葉、酒糟經(jīng)發(fā)酵而制成的干燥曲塊，每五倍子100 kg，用茶葉6.2 kg，酒糟25 kg[1]。因其具有清熱化痰，生津止渴等功效，臨床上可用于肺熱咳嗽，風(fēng)火牙痛，口舌糜爛，久痢脫肛。方中要藥五倍子主要成分為可水解鞣質(zhì)，水解后的產(chǎn)物主要為沒食子酸[2]，因此通過測定沒食子酸的含量，可以建立一種百藥煎的含量控制方法。目前百藥煎在《浙江省炮制規(guī)范》2005版有收載，但尚未見其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為控制百藥煎質(zhì)量，確保其臨床用藥的安全有效，本實(shí)驗(yàn)對(duì)百藥煎的顯微特征、薄層鑒別、檢查( 水分、總灰分、酸不溶性灰分、黃曲霉毒素) 及沒食子酸含量測定進(jìn)行研究，旨在為系統(tǒng)評(píng)價(jià)百藥煎質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀（二元梯度泵、柱溫箱、PDA檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器、Labsolution工作站）；Alltech 426高效液相色譜儀；島津RF-20A熒光檢測器；PriboFast柱后衍生儀；四合一酶聯(lián)免疫親和柱（北京泰樂祺科技有限公司）。BSA224S分析天平(德國Sartorius系列)； SRIX-4-13箱式電阻爐（北京中興儀器偉業(yè)有限公司）；UPH-I-10T優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）；ZF-90多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠），LeicaDM2000生物顯微鏡（Leica Microsystems CMSGmbH）。

1.2 試藥與樣品

沒食子酸對(duì)照品，(批號(hào)：110831-201204)，由中國食品藥品檢定研究院提供，五倍子對(duì)照藥材，(批號(hào)：121078-200402)，由中國藥品生物制品檢定所提供。色譜級(jí)甲醇，水為超純水；鹽酸，磷酸，甲醇等試劑均為分析純。8批百藥煎樣品，經(jīng)過成都中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本中心盧先明教授鑒定，7批為五倍子、茶葉、酒糟經(jīng)發(fā)酵而制成的干燥曲塊，其中一批為缺五倍子陰性樣品。詳見表1。

表1 百藥煎樣品來源表

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

粉末淡灰褐色，非腺毛長70～140 μm，有時(shí)長達(dá)350 μm。薄壁細(xì)胞類圓形，內(nèi)含淀粉粒，淀粉粒多糊化。見圖1、2。

圖1

圖2

2.2 TLC 鑒別

2.2.1 供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液的制備 取百藥煎樣品粉末0．5 g，加甲醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取五倍子對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取沒食子酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 TLC試驗(yàn) 照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5：5：1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。本方法分離效果好，斑點(diǎn)清晰，重復(fù)性好。見圖3。

圖3 百藥煎樣品TLC1.沒食子酸對(duì)照品 2.五倍子對(duì)照藥材3～9.分別為7批百藥煎樣品（詳見表1）

2.3 水分、總灰分和酸不溶性灰分檢查

水分、總灰分和酸不溶性灰分測定分別參考《中國藥典》2010版一部附錄ⅨH 水分測定法第一法、ⅨK 灰分測定法，結(jié)果見表2。根據(jù)測定結(jié)果，建議規(guī)定百藥煎水分不得超過11．0%，總灰分不得超過4．0%，酸不溶性灰分不得超過1．0%。

表2 百藥煎樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分及沒食子酸含量測定結(jié)果 %

2.4 黃曲霉毒素檢查

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙腈-水（30∶10∶60）為流動(dòng)相；采用光化學(xué)衍生法：光化學(xué)衍生器（254 nm）；以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex＝360 nm，發(fā)射波長λem＝450 nm。兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1．5。結(jié)果見圖4。

2.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1．0 μg．mL-1、0．3 μg．mL-1、1．0 μg．mL-1、0．3 μg．mL-1）1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液1 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，既得。

2.4.3 供試品溶液制備 取百藥煎樣品粉末約15 g（過二號(hào)篩），精密稱定，加入氯化鈉3 g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%的甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min（攪拌速度大于11000 r．min-1），離心5 min（離心轉(zhuǎn)速2500 r．min-1），精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過，量取續(xù)濾液20 mL，通過免疫親和柱，流速每分鐘3 mL，反復(fù)2次，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖4 百藥煎中黃曲霉毒素HPLCA.黃曲霉毒素混合對(duì)照品；B.百藥煎樣品；1.黃曲霉毒素G2；2.黃曲霉毒素G1；3.黃曲霉毒素B2；4.黃曲霉毒素B1

2.4.4 測定法 分別吸取上述混合對(duì)照溶液5，10，15，20，25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取上述供試品溶液20～25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2的量，計(jì)算，即得。

2.4.5 黃曲霉毒素含量測定 取各百藥煎樣品粉末，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件以及“2.4.4”項(xiàng)下供試品溶液測定法測定，根據(jù)測定結(jié)果，建議規(guī)定百藥煎中不得檢出黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0．1%磷酸溶液(15:85)為流動(dòng)相；流速: 1．0 mL．min-1; 檢測波長: 273 nm; 進(jìn)樣量: 10 μL; 柱溫: 25℃。理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，結(jié)果見圖5。

圖5 百藥煎中沒食子酸HPLCA.沒食子酸對(duì)照品；B.百藥煎樣品；C.缺陰性對(duì)照溶液；1.沒食子酸

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備及線性關(guān)系考察 精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得沒食子酸對(duì)照品溶液。精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液（40 μg．mL-1）6，8，10，12，14，16 μL,在上述色譜條件下，依次進(jìn)樣，以沒食子酸濃度(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程為y=5000000x-6601．1,R=0．9999，結(jié)果表明沒食子酸在0．24～0．64 μg范圍內(nèi)，其峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

2.5.3 供試品溶液的制備 取百藥煎樣品粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，精密加入4 mol．L-1鹽酸溶液50mL，水浴中加熱水解3.5 h ，放冷，濾過。精密量取續(xù)濾液1 mL，置100 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.5.4 精密度試驗(yàn) 取40 μg．mL-1的沒食子酸對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)6次，測定峰面積，結(jié)果峰面積值的RSD為0．22%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份同一批次樣品（批號(hào):20140701）各約0.5 g，精密稱定，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，結(jié)果測得沒食子酸含量的RSD為3．2%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20140701）約0.25 g，精密稱定，共6份。分別加入沒食子酸對(duì)照品溶液（2．5 mg．mL-1）10 mL，依次測定，計(jì)算含量，并計(jì)算回收率，沒食子酸平均回收率為99．43%，RSD為0．79%。結(jié)果表明該方法回收率良好，符合HPLC 含量測定要求，見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取百藥煎（批號(hào)20140702）供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12，24 h，進(jìn)樣10 μl測定峰面積，計(jì)算得RSD為1．2%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 含量測定 取各百藥煎樣品粉末0.5 g，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算百分含量，沒食子酸含量測定結(jié)果見表2，平均含量( 按干燥品計(jì)算) 為41.5%。根據(jù)測定結(jié)果，建議規(guī)定百藥煎中沒食子酸含量不得低于33.0%。

3 討論

首先本文對(duì)百藥煎樣品水解時(shí)間進(jìn)行考察,結(jié)果顯示，樣品在3．5 h 時(shí)沒食子酸含量最高，說明已水解完全。其次百藥煎中五倍子與茶葉中均含有沒食子酸，且五倍子為百藥煎主要成分，含量占近80%，而茶葉含量僅占不足5%。許多研究表明[3～5]，茶葉中沒食子酸含量不超過1%。因此，茶葉中存在的少量沒食子酸不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾，故為了保證百藥煎質(zhì)量及療效，通過測定沒食子酸的含量，可有效的定量控制百藥煎的質(zhì)量。另外本文采用高效液相色譜法對(duì)百藥煎中沒食子酸的含量測定進(jìn)行了研究，建立了百藥煎中沒食子酸含量的HPLC測定法，本測定方法取樣量少，所用溶劑毒性小，方法簡便易操作，可重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為質(zhì)量控制分析方法，為百藥煎中沒食子酸的含量測定提供了一種可借鑒的、準(zhǔn)確有效的方法。

[1] 鄭尚金,陳時(shí)飛,陸光照,等.浙江省中藥炮制規(guī)范:2005年版[M].杭州: 浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2005:539.

[2] 劉起中,張可可.HPLC測定五倍子中沒食子酸的含量[J].中草藥,2002,33(5):427.

[3] 熊鳳麟,袁呂江,吳光權(quán)等.高效液相色譜法同時(shí)測定茶葉中維生素C、沒食子酸和咖啡堿的含量[J].色譜,1993,11(6):366-368.

[4] 鄒盛勤,姜瓊.RP—HPLC測定茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(7):322-324.

[5] 李銀花,李娟,龔雪等. 高效液相色譜法同時(shí)測定茶葉中8種兒茶素、3種嘌呤堿和沒食子酸[J].食品科學(xué),2011,32(18):214-217.

（責(zé)任編輯：傅舒）

Study on quality standard of Baiyaojian/

XIAO Fang, HUANG Qin-wan, YI Jia-jia// (Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To establish the quality standard of Baiyaojian. Method: With gallic acid as reference, TLC was used to detect Baiyaojian. HPLC was adopted to determine the content of gallic acid. Moisture, total ash, acid insoluble ash and aflatoxin were determined. And the microscopic identification was also carried out. Result: Baiyaojian had obvious microscopic characteristics. The TLC identification had a good resolution with clear spots．According to the measurement results, moisture in Baiyaojian should be no more than 11.0 %, the content of total ash no more than 4.0 %，and the content of acid-insoluble ash no more than 1.0%．The peak area of gallic acid was in a good linear relationshipin the range of 0.24～0.64 μg (r＝0.9999). The average recovery was 99.43% with RSD of 0.79 %. The content of gallic acid should be above 33.0%. Conclusion: The established standard is acceptable for quality evaluation of Baiyaojian．

Baiyaojian; quality standard; TLC identification; content determination; gallic acid

R283.3

A

1674-926X(2016)04-006-04

四川省科技廳支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012FZ0017），

成都市科技局課題（編號(hào)：12DXYB310JH），

四川省教育廳青年基金（編號(hào)：10ZC051）。

成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

肖 芳，在讀碩士，主要從事中藥炮制學(xué)研究。

Tel:18482177688 Email:329065965@qq.com

黃勤挽，博士，副教授，主要從事中藥炮制學(xué)研究。Tel:13982199974 Email:36190587@qq.com

2015.08.24