徐穎，李勁松，孫濤

·藥理毒理·

山楂葉總黃酮對(duì)肥大心肌細(xì)胞線粒體功能的影響

徐穎1，李勁松2，孫濤1

山楂葉總黃酮為山楂葉的主要活性物質(zhì)群，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用集中于心腦血管方向，其作用機(jī)制主要為抗氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)細(xì)胞線粒體功能等。本文采用AngII致心肌細(xì)胞肥大模型，研究山楂葉總黃酮對(duì)肥大心肌細(xì)胞線粒體功能的影響，以期為山楂葉總黃酮治療心衰的線粒體保護(hù)途徑提供研究思路。

山楂葉；總黃酮；線粒體功能

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge. var. major N. E. Br.或山楂C.pinnatifida Bge.的葉，具有活血化瘀、理氣通脈的功效。在我國(guó)，早在東晉《肘后方》中就有山楂葉“莖葉煮汁，洗漆瘡”的記載，2010版《中國(guó)藥典》正式收載山楂葉。

黃酮類化合物作為山楂葉的主要活性物質(zhì)群，主要包括槲皮素、金絲桃苷、牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷等，最新研究顯示，山楂葉總黃酮（Hawthorn leaves flavonoids，HLF）藥理作用主要集中于心血管方向，包括：調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗動(dòng)脈粥樣硬化、對(duì)心、腦、腎等器官組織缺血再灌注損傷病理程度的改善及保護(hù)等作用，其機(jī)制主要涉及清除氧自由基，降低血清總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）量，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）/TC比值，改善細(xì)胞功能代謝，保護(hù)細(xì)胞線粒體功能，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子及基因的表達(dá)等。

在慢性心衰的各種病理改變中，線粒體的結(jié)構(gòu)與功能的改變處于中心地位。心臟通過(guò)能量代謝將儲(chǔ)存于脂肪酸和葡萄糖中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，為心臟的收縮和舒張等耗能過(guò)程提供能量。因此，本研究從心衰的線粒體功能途徑入手，研究HLF對(duì)心衰細(xì)胞模型（AngII致心肌細(xì)胞肥大）線粒體功能的干預(yù)及影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

山楂葉總黃酮（HLF，Hawthorn leaves flavonoids，純度＞90%）購(gòu)于山西晉城中晉藥業(yè)公司；纈沙坦（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；II型膠原酶、Ang II、5-溴脫氧尿嘧啶、D-Hanks溶液（Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素（Gibco公司）；細(xì)胞增殖試劑盒IIXTT（Roche公司）；96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）；動(dòng)物細(xì)胞/組織高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒、純化線粒體蛋白質(zhì)濃度定量測(cè)定試劑盒、線粒體內(nèi)膜功能/膜電位（JC-1）測(cè)定試劑盒、線粒體外膜功能檢測(cè)試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 儀器

電動(dòng)移液器（Eppendorf公司）；電子天平（Sartorius公司）；超凈工作臺(tái)（上海博迅公司）；倒置熒光顯微鏡（Leica公司）；酶標(biāo)儀、CΟ2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；低溫離心機(jī)（Beckman 公司）。

1.3 方法

1.3.1 心肌細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)、鑒定 參考文獻(xiàn)[1]并改進(jìn)如下：1～3 d SD乳鼠，取出心臟，置于預(yù)冷的D-hanks溶液，眼科剪減去心臟的1/2，留心尖部心室組織；然后分別沿橫、縱兩個(gè)方向剪開(kāi)剩余心室組織，放入0.1%的胰蛋白酶中，置于搖床上往復(fù)30 次/min速度，4℃冰箱震蕩過(guò)夜。第2日加入胰蛋白酶等體積的培養(yǎng)液，37℃水浴箱以往復(fù)60 次/min的速度震蕩10 min后終止消化，棄上清。加入濃度為0.08%Ⅱ型膠原酶，置37℃水浴箱以60 次/min的速度震蕩10 min，收集上清，并用等體積的培養(yǎng)液中和收集到的上清液。此步驟重復(fù)3～5次，直至組織基本消化為止。收集各次消化的液體，1500 r．min-1離心5 min，棄上清，用DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。采用差速貼壁進(jìn)行分離，收集細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM稀釋，同時(shí)，每10 mL細(xì)胞懸液中加入80 μL5-溴脫氧尿嘧啶以抑制非心肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種細(xì)胞，培養(yǎng)3天后使用。常規(guī)免疫組化方法進(jìn)行鑒定，一抗選擇大鼠α-橫紋肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，SABC染色，DAB顯色。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 綜合XTT細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分組及給藥濃度設(shè)定如下，分別為：空白對(duì)照組（心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)）；AngII組（1 μmol．L-1）、AngII（1 μmol．L-1）+纈沙坦（1 μmol．L-1）組、AngII（1 μmol．L-1）+HLF（200 μg．mL-1）組。

1.3.3 心肌細(xì)胞直徑及總蛋白含量測(cè)定 心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)3 d后，含1.5%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分組給藥作用72 h，倒置熒光顯微鏡觀察、拍照，圖像分析軟件測(cè)量心肌細(xì)胞直徑，計(jì)算平均值；BCA法測(cè)定心肌細(xì)胞總蛋白含量。

1.3.4 心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位測(cè)定 陽(yáng)離子熒光羰花青染色劑JC-1是一種對(duì)膜電位高度敏感的染色劑。它能夠特異性地進(jìn)入線粒體，分布和結(jié)合在線粒體基質(zhì)上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高，JC-1形成聚集體，而濃度高，熒光顯色為紅色或桔紅色；反之，則為綠色。心肌細(xì)胞細(xì)預(yù)處理方法及作用時(shí)間同1.3.3，嚴(yán)格按照心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)步驟操作：使用倒置熒光顯微鏡觀察紅、綠熒光，熒光條件設(shè)定如下：觀察紅色熒光（濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490 nm、散發(fā)波長(zhǎng)590 nm）；觀察綠色熒光（濾波器激發(fā)波長(zhǎng)490 nm、散發(fā)波長(zhǎng)530 nm）；顯微鏡圖像分析軟件計(jì)算MMP（紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度比值），若MMP降低則提示心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能損害。

1.3.5 心肌細(xì)胞線粒體膜外膜功能測(cè)定 細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase，CΟX）存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，主要通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量。作為線粒體外膜功能的生物標(biāo)記，通過(guò)測(cè)定在去垢劑（既使CΟX酶保持活性，又使外膜充分裂解）存在與否的條件下，線粒體的酶含量變化，來(lái)衡量線粒體外膜的完整性。心肌細(xì)胞細(xì)預(yù)處理方法及作用時(shí)間同1.3.3，嚴(yán)格按照高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒及線粒體外膜功能檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)步驟操作：計(jì)算線粒體膜外損傷率（稀釋液處理的心肌細(xì)胞線粒體樣品為損傷線粒體釋放的CΟX活性，裂解液處理的為總CΟX活性，前者與后者的比值即為線粒體外膜損傷率）。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用 ±s代表，采用spss15統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P ＜0.05 表示有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定

與空白對(duì)照組相比，AngII組能顯著增加心肌細(xì)胞總蛋白含量；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著降低異常升高的總蛋白含量，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 心肌細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定（±s）

表1 心肌細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定（±s）

組別 劑量 n 總蛋白含量(mg/106 cell)空白對(duì)照 — 3 0.688 ±0.082

注：與空白對(duì)照組比，**P＜0.01；與AngII組比較，△△P＜0.01

2.2 心肌細(xì)胞直徑測(cè)定

與空白對(duì)照組相比，AngII組能顯著增加心肌細(xì)胞直徑；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著降低異常升高的心肌細(xì)胞直徑，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 心肌細(xì)胞直徑測(cè)定（±s）

表2 心肌細(xì)胞直徑測(cè)定（±s）

注：與空白對(duì)照組比，**P＜0.01；與AngⅠⅠ組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量 n 細(xì)胞直徑（μm）空白對(duì)照 — 3 18.370±1.439 AngII 1 μmol．L-13 25.073±2.040** AngII+纈沙坦 1 μmol．L-1+1 μmol．L-13 21.317±1.888△△AngII+HLF 1 μmol．L-1+200 μg．mL-13 22.338±2.611△

2.3 心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位測(cè)定

與空白對(duì)照組相比，AngII組能顯著降低MMP；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著升高異常降低的MMP，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 心肌細(xì)胞粒體內(nèi)膜功能/膜電位測(cè)定（±s）

表3 心肌細(xì)胞粒體內(nèi)膜功能/膜電位測(cè)定（±s）

注：與空白對(duì)照組比，**P＜0.01；與AngII組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量 nMMP(紅/綠熒光強(qiáng)度)空白對(duì)照 — 3 2.900±0.639 AngII 1 μmol．L-13 1.167±0.162** AngII+纈沙坦 1 μmol．L-1+1 μmol．L-13 2.186±0.163△△AngII+HLF 1 μmol．L-1+200 μg．mL-13 1.650±0.297△

2.4 心肌細(xì)胞線粒體外膜功能測(cè)定

與空白對(duì)照組相比，AngII組能顯著升高外膜損傷率；與AngII比較，AngII+纈沙坦組、AngII+HLF能夠顯著降低異常升高的外膜損傷率，結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 心肌細(xì)胞線粒體外膜功能測(cè)定（±s）

表4 心肌細(xì)胞線粒體外膜功能測(cè)定（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與AngII組比較，△△P＜0.01

組別 劑量 n外膜損傷率（%）空白對(duì)照 — 3 3.997±0.730 AngII 1μmol．L-13 12.377±1.494** AngII+纈沙坦 1μmol．L-1+1μmol．L-13 8.453±1.021△△AngII+HLF 1μmol．L-1+200μmol．L-13 10.042±1.305△△

3 討論

黃酮作為一種天然的抗氧化劑，對(duì)于很多細(xì)胞都能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用。山楂葉中富含黃酮，其黃酮含量超過(guò)山楂的其它有效部位。通過(guò)色譜法研究發(fā)現(xiàn)，HLF中含有槲皮素、牡荊黃素，pinnatifidaC、pinnatifidaD等[2～4]。

目前，國(guó)內(nèi)以山楂葉總黃酮為主的制劑益心酮片、膠囊等近年來(lái)在臨床上被用于高血壓、高血脂、冠心病等疾病的治療。歐洲的最新研究結(jié)果顯示[5]，歐洲屬山楂葉提取物WS1442（從山楂葉中提取出來(lái)的一種天然的抗氧化劑，主要成分為黃酮和聚合黃烷類，在一部分歐洲國(guó)家，已被批準(zhǔn)用于治療早期的充血性心衰）可安全延長(zhǎng)已接受過(guò)藥物治療的充血性心衰患者的生命，歐洲的156個(gè)研究中心共同實(shí)施了隨機(jī)雙盲臨床實(shí)驗(yàn)—SPICE研究。該研究中84%的受試者是男性，44%的患者心功能受損嚴(yán)重，前18個(gè)月的研究顯示，WS1442組的患者心源性死亡率減少20%，壽命延長(zhǎng)了4個(gè)月。

在慢性心衰的各種病理改變中，線粒體的結(jié)構(gòu)與功能的改變處于中心地位。心臟通過(guò)能量代謝將儲(chǔ)存于脂肪酸和葡萄糖中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，為心臟的收縮和舒張等耗能過(guò)程提供能量。

因此，本研究從心衰的線粒體功能途徑入手，研究HLF對(duì)心衰細(xì)胞模型（AngII致心肌細(xì)胞肥大）線粒體功能的干預(yù)及影響，結(jié)果顯示：山楂葉總黃酮200μg．mL濃度組，能顯著降低AngII所致異常升高的總蛋白含量、心肌細(xì)胞直徑、線粒體外膜損傷率；顯著升高AngII所致異常降低的MMP。故推測(cè)山楂葉總黃酮是通過(guò)干預(yù)及影響肥大心肌細(xì)胞線粒體功能來(lái)發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

[1] 陶靜,馬依彤,李曉梅.原代乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J].中華心血管病雜志,2014,42(01):53.

[2] PC, Z. and X. SX, Flavonoid Ketohexose furanosides from the leaves of Crataegus pinnatifida Bge[J] . Var. majo r N. E. B r.Phytochemistry, 2001,57(8): 1249.

[3] Rice-Evans, C.A., et al. The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids[J]. Free Radic Res, 1995.22(4):375.

[4] Castelluccio, C., et al. Antioxidant potential of intermediates in phenylpropanoid metabolism in higher plants[J]. FEBS Letters, 1995. 368(1): 188.

[5] Vanden Hoek, T.L., et al. Significant Levels of Οxidants are Generated by Isolated Cardiomyocytes During Ischemia Prior to Reperfusion[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1997. 29(9): 2571.

（責(zé)任編輯：陳思敏）

The study of the effect of Hawthorn leaves flavonoids on the mitochondrial function of hypertrophic cardiomyocytes/

XU Ying1, LI Jing-song2, SUN Tao1//(1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. The first People's Hospital of Guangyuan, Guangyuan 628017, Sichuan)

The flavonoids are the main active substance groups of Hawthorn leaves. Recent study showed that the pharmacological research of Hawthorn leaves flavonoids are focused on heart and cerebral vessels. Main mechanism involved are anti-oxidative stress damage and protection of the function of mitochondria of cells. AngII-induced cardiomyocyte hypertrophy model are used to study the effect of Hawthorn leaves flavonoids on the mitochondrial function of hypertrophic cardiomyocytes, and to provide research ideas for the mitochondrial protection of Hawthorn leaves flavonoids in treatment of heart failure.

Hawthorn leaves; flavonoids; mitochondrial function

R 285.5

A

1674-926X(2016)04-011-03

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào): 2013JY0068)；四川省中醫(yī)藥管理局中藥基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(編號(hào):2014F013)；廣元市科技局科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):14KJZCS003)；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金(編號(hào):030029041)；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金(編號(hào):030029053)

1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；

2. 廣元市第一人民醫(yī)院，四川 廣元 628017

徐穎，講師，主要從事中藥藥理研究

Email:497412855@qq.com

孫濤，副教授，主要從事中藥藥理研究

Email:suntao2178@126.com

2016-06-23