吳珊珊，胡麟，龔曉猛，李夢(mèng)琪，吳文輝，李文兵，胡昌江

·品種品質(zhì)·

黃柏中多種生物堿測(cè)定的NIR模型的建立

吳珊珊1，胡麟1，龔曉猛1，李夢(mèng)琪1，吳文輝1，李文兵2，胡昌江1

目的：建立黃柏中3個(gè)成分（木蘭花堿、黃柏堿、小檗堿）測(cè)定的NIR模型。方法：以高效液相測(cè)定的黃柏生物堿含量值作為參照，運(yùn)用近紅外漫反射光譜采集49批不同產(chǎn)地樣品的近紅外漫反射光譜，采用偏最小二乘算法( PLS) 建立校正模型，比較不同的預(yù)處理方法及不同的波段對(duì)建模的影響。結(jié)果：以MSC+2D2為預(yù)處理方法，建立的小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿模型交互驗(yàn)證均方根誤差（RMSEC）分別為0.0453、0.0335 、0.0396，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9995、0.9760、0.9306。結(jié)論：建立的NIR模型穩(wěn)定準(zhǔn)確可靠，適用于生產(chǎn)中快速在線(xiàn)檢測(cè)。

近紅外光譜；黃柏；PLS；生物堿

黃柏是“三木藥材”之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。具有兩千多年的藥用歷史。性味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1]。鹽炙可引藥入腎，緩和苦燥之性，增強(qiáng)滋腎陰、瀉相火、退虛熱的作用；酒炙后可降低苦寒之性，免傷脾陽(yáng)，并借酒升騰之力，引藥上行，清血分濕熱。[2]黃柏中主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類(lèi)，其中含量最高的為小檗堿[3,4]。目前，黃柏質(zhì)量控制的方法主要是通過(guò)運(yùn)用相應(yīng)的對(duì)照品進(jìn)行黃柏藥材中不同成分的含量測(cè)定以及運(yùn)用指紋圖譜方法控制黃柏的整體質(zhì)量。需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的樣品制備和預(yù)處理，分析時(shí)間長(zhǎng)。近紅外(near infrared, NIR) 光譜分析是近年來(lái)快速發(fā)展的一種分析技術(shù)，適合于復(fù)雜天然產(chǎn)物的定性和定量分析。與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比，近紅外光譜分析技術(shù)被測(cè)樣品用量小、無(wú)破壞、無(wú)污染，具有高效、快速、成本低和綠色的特點(diǎn)。[5～8]因此，近紅外光譜在中草藥及其產(chǎn)品的定量定性?xún)煞矫娑嫉玫綉?yīng)用。因其快速簡(jiǎn)便，在藥廠(chǎng)中也廣泛應(yīng)用于藥材中間產(chǎn)物和成品的質(zhì)量控制。在定性分析中，常用于中藥材真?zhèn)巍a(chǎn)地的鑒別及相似、相近藥材的區(qū)分和鑒定。定量分析中主要用于有效成分含量的測(cè)定。[9～11]本實(shí)驗(yàn)以黃柏為研究對(duì)象，以高效液相作為參比方法，采集黃柏粉末近紅外光譜圖，采用偏最小二乘法建立定量校正模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)黃柏中幾種生物堿含量的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確測(cè)定。

1 儀器與材料

Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（配有Thermo Result信號(hào)采集軟件，TQ Analyst數(shù)據(jù)處理軟件，積分球漫反射采樣系統(tǒng)），Agilent 1200 高效液相系統(tǒng)，F(xiàn)E20梅特勒-托利多pH 計(jì)，Sartorius BP211D 電子分析天平，KQ-300E 超聲儀（40 kW），乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。木蘭花堿（Must-12022901）、鹽酸黃柏堿（Must-12021407）、和鹽酸小檗堿（Must-111212110）均購(gòu)自成都曼思特生物制品檢定所，HPLC（峰面積歸一化法）純度為98%。

49批黃柏購(gòu)自四川、貴州、湖南、湖北等地藥材市場(chǎng)和飲片公司，經(jīng)本校生藥室教研室盧先明老師鑒定為黃皮樹(shù)Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹(shù)皮。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 近紅外光譜的采集

樣品過(guò)4號(hào)篩，裝入樣品杯中，采集方式為積分球（旋轉(zhuǎn)樣品），掃描范圍10 000～4 000 cm-1，掃描64 次，增益2X，分辨率8 cm-1，empty 門(mén)衰減。每份樣品重復(fù)掃描3 次， 計(jì)算平均光譜， 每次掃描前都要對(duì)樣品進(jìn)行混勻。圖1為49批黃柏樣品的近紅外光譜疊加圖。

圖1 不同產(chǎn)地黃柏近紅外原始光譜圖

2.2 HPLC含量測(cè)定[12]

2.2.1 HPLC測(cè)定生物堿含量條件 同時(shí)利用高效液相色譜法測(cè)定各批次黃柏粉末中木蘭花堿、黃柏堿和小檗堿的含量。其測(cè)定條件為流動(dòng)相A：乙腈-0.05 mol．L-1磷酸二氫鉀（KH2PΟ4）（45∶55）（每100 mL 中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH值至4.8），流動(dòng)相B：乙腈-0.05 mol．L-1KH2PΟ4（55∶45）（每100 mL 中加入0.4 g 十二烷基硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH值至4.5），梯度洗脫程序0～12 min，0 B， 12～18 min， 0～100% B ， 18～40 min，100 %B， 40～42 min，100～0% B，42～48 min 0% B。流速 1 mL．min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2.2.2 樣品含量測(cè)定 對(duì)49份樣品進(jìn)行HPLC含量測(cè)定，每份樣品平行測(cè)量2次，計(jì)算平均值。樣品中木蘭花堿、小檗堿、黃柏堿的含量范圍分別為0.10～1.01%、1.22～9.53%、0.19～0.90%。

2.3 模型的建立的方法

將49 份樣品的近紅外光譜與HPLC 值相關(guān)聯(lián)，輸入到TQ 8.0定量分析軟件中，隨機(jī)分為校正集和驗(yàn)證集，要保證驗(yàn)證集的含量范圍在校正集的含量范圍之內(nèi)。采用偏最小二乘法(PLS) 建立定量分析模型，用驗(yàn)證集驗(yàn)證該模型，并以校正集決定系數(shù)(R2)、校正集均方差(RMSECV) 、預(yù)測(cè)均方差(RMSEP) 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)優(yōu)化模型性能。R2越大、RMSECV 越小， 表明模型結(jié)構(gòu)越合理，RMSEP 越小，表明模型的預(yù)測(cè)性能和推廣能力越強(qiáng)。

2.4 光譜預(yù)處理方法的選擇

運(yùn)用光譜分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，比較主成分回歸法(PCR)和偏最小二乘法(PLS)的建模結(jié)果。結(jié)果表明PLS所建立的模型R2較大而RMSEC，表明所建模型適用性強(qiáng)、預(yù)測(cè)效果好，優(yōu)于PCR法，故選定采用PLS法建立定量校正模型。

本實(shí)驗(yàn)首先結(jié)合多元散射校正(MSC)以及標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換(SNV)兩種方法進(jìn)行光譜預(yù)處理，同時(shí)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，主要用導(dǎo)數(shù)和Norris平滑對(duì)NIR光譜進(jìn)行預(yù)處理，用以消除光譜散射和基線(xiàn)飄移，導(dǎo)數(shù)光譜分別采取一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)處理。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同預(yù)處理方法對(duì)校正模型影響

2.5 波段的選擇

PLS全譜建模需要大量計(jì)算，同時(shí)易引入過(guò)多冗余信息，因此需對(duì)建模波段進(jìn)行選擇，提高模型的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)以MSC+2D2為預(yù)處理方法，根據(jù)R2、RMSEC值作為指標(biāo)選擇較優(yōu)的波段。最終確定4342.91-5006.3,5804.68-7500,8000-10000為建模波段。考察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 光譜波段選取對(duì)PLS 模型影響

2.6 校正模型的建立及驗(yàn)證

根據(jù)不同產(chǎn)地黃柏和黃柏樣品中的生物堿分布情況，從49份樣品中選擇34個(gè)樣品作為校正集，15個(gè)樣品作為驗(yàn)證集。為使校正集樣品更具代表性，驗(yàn)證集樣品的生物堿含量范圍應(yīng)在校正集含量之內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)圖2。用樣品的校正集建立校正模型，再做交叉檢驗(yàn)。最后用驗(yàn)證集樣品對(duì)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證。

圖2 小檗堿 (A)、黃柏堿 (B)、木蘭花堿 (C) 的校正集樣品預(yù)測(cè)值與測(cè)量值之間的相關(guān)圖

3 討論

本研究通過(guò)NIR 光譜法對(duì)黃柏主要生物堿進(jìn)行含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)考察PLS法和PCR法，結(jié)合多元散射校正(MSC) 以及標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換(SNV) 兩種方法進(jìn)行光譜預(yù)處理，最終選擇用PLS法，MSC+2D2為預(yù)處理方法。該方法高效，快速，一個(gè)樣品只需1～2 min便可得出結(jié)果。同時(shí)，樣品預(yù)處理方法簡(jiǎn)單，測(cè)定過(guò)程中對(duì)樣品無(wú)污染，為黃柏的快速評(píng)價(jià)和在線(xiàn)檢測(cè)提供了參考和依據(jù)。但本試驗(yàn)樣品批次較少且不包括炮制品和和配方顆粒等飲片形式的樣品，因此要建立完全適合生產(chǎn)科研精度需要的相關(guān)分析模型，有待于進(jìn)一步的研究分析。

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（責(zé)任編輯：胡慧玲）

Determination of alkaloid in Huangbo by near infrared diffuse reflectance spectroscopy

WU Shan-shan1, HU Lin1, GONG Xiao-meng1, LI Meng-qi1, WU Wen-hui1,LI Wen-bing2, HU Chang-jiang1//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Neo-green Pharmaceutical Co.LTD, Chengdu 611930, Sichuan)

Objective: A near-infrared (NIR) quantitative method was developed for rapid determination of three components (magnoflorine, phellodendrine, and berberine) in Huangbo. Method: Using alkaloid contents measured by HPLC as reference, near infrared diffuse reflectance spectroscopy of 49 samples were collected. Then partial least square algorithm (PLS) was applied to establish a calibration model, and compare the influence of different pretreatment method and different wave on modeling. Result: Taking MSC +2 D2as pretreatment method, model correlation coefficient (R) for berberine, phellodendrine, magnoflorine were 0.9995, 0.9760 and 0.9306 with RMSEC of 0.0453, 0.0335 and 0.0396, respectively. Conclusion: The method is accurate and reliable, and can be applied for the rapid online detection.

Near infrared spectrum; Huangbo; partial least square algorithm; alkaloid

R282.6

A

1674-926X(2016)04-002-03

中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201007012-3-2）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 成都 611137; 2.四川新綠色科技發(fā)展股份有限公司 成都 611930

吳珊珊（1989-），女，在讀博士研究生，主要從事中藥炮制機(jī)理研究

Tel:15802825791 Email:569222020@qq.com

胡昌江（1952-），男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制機(jī)理研究

Email:hhccjj@hotmail.com

2015-09-10