孔令提，劉 冬，宋春麗，朱裕林

(1.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233004； 2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 408400)

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采用Caco-2細胞轉運模型研究胺碘酮轉運機制及阿托伐他汀對其轉運的影響

孔令提，劉 冬，宋春麗，朱裕林

(1.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233004； 2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 408400)

目的：探討胺碘酮的腸吸收特性，評價聯(lián)合應用阿托伐他汀是否影響胺碘酮的腸吸收。方法：采用Caco-2細胞轉運模型，研究胺碘酮在不同濃度下從絨毛面(apical，AP)側到基底面(basolateral，BL)側，以及從BL側到AP側2個方向的轉運過程，計算表觀滲透系數(apparent permeability coefficient，Papp)，考察其跨膜轉運機制，同時考察維拉帕米、阿托伐他汀對其Papp值的影響。結果：不同濃度(10、20、40 μmol/L)胺碘酮的雙側轉運量均隨濃度增高而相應增大；不同濃度胺碘酮雙向轉運Papp值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且外排比率均<1.5；加入維拉帕米或阿托伐他汀對胺碘酮的Papp值無顯著影響(P>0.05)；表明胺碘酮的腸吸收轉運機制為被動擴散。結論：胺碘酮的腸吸收轉運機制為被動擴散，聯(lián)合應用阿托伐他汀時不會影響胺碘酮的腸吸收。

胺碘酮； 阿托伐他?。?Caco-2細胞模型； 表觀滲透系數

胺碘酮是一種以Ⅲ類藥理作用為主的心臟離子多通道阻滯劑，臨床適用于房性、室性、結性及伴預激綜合征(W-P-W綜合征)的心律失常，是目前最常用的抗心律失常藥之一[1]。阿托伐他汀除具有調節(jié)血脂作用外，還具有抑制血管內皮的炎癥反應、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、改善血管內皮功能等作用，臨床常與胺碘酮聯(lián)合應用[2-5]，但兩者之間是否存在相互作用尚不明確。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是小腸上皮細胞上一種主要的轉運蛋白，可將細胞內藥物(底物)逆濃度轉運至細胞外，從而影響口服藥物的生物利用度[6]。Caco-2細胞可通過上皮樣分化而形成緊密連接，其在形態(tài)學、標志酶的功能表達及滲透性等方面具有與小腸上皮細胞相同的特性，具有P-gp高表達特性，與藥物的體內吸收具有良好的相關性，目前被廣泛用于新藥篩選及藥物吸收性相互作用的研究[7-9]。本研究采用Caco-2細胞轉運模型探討胺碘酮的腸吸收特性，同時研究阿托伐他汀對胺碘酮在小腸吸收的影響，以評價兩者是否存在吸收性藥物相互作用。

1 材料

1.1 儀器

EVOM細胞電位儀(美國Millipore公司)；細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；酶標儀(美國Bio-Tek公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑

Caco-2細胞株(中科院上海細胞庫，傳代數為30～40代)；胎牛血清、非必需氨基酸、雙抗(美國Gibco公司)；DMEM液體培養(yǎng)基、漢克平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(北京索萊寶公司)；6孔Transwell培養(yǎng)板(美國Costar公司)；胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、噻唑蘭(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、鼠尾膠原蛋白(美國Sigma公司)；鹽酸胺碘酮標準品、黃體酮標準品(中國食品藥品檢定研究院提供)；乙腈、三乙胺均為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細胞復蘇

將Caco-2細胞株從液氮中取出，置于37 ℃水浴中不斷振搖，待化凍完畢后移至超 凈臺，取出細胞懸液，加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(下同)，離心(轉速1 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入5 ml DMEM培養(yǎng)液，吹散細胞，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱(下同)中培養(yǎng)。

2.2 細胞培養(yǎng)和傳代

當細胞生長至單層融合約80%時，移除培養(yǎng)基，用PBS潤洗2次，加入胰蛋白酶消化，置于培養(yǎng)箱中，5 min后取出，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，用滅菌吸管吹打成細胞懸液，離心(轉速1 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入含有DMEM培養(yǎng)液，吹散細胞，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 細胞毒性實驗

將對數生長期的Caco-2細胞胰酶消化后，調整細胞密度至5×105個/ml，加入96孔板，每孔接種100 μl，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后分別加入系列濃度的胺碘酮溶液100 μl(DMSO終濃度為1%)，并將含1% DMSO的HBSS溶液作為陰性對照，于培養(yǎng)箱中孵育3 h后，吸出上清液，加入空白HBSS 100 μl及MTT(5 mg/ml)20 μl，再培養(yǎng)4 h，吸出上清液，加入DMSO 100 μl，待甲瓚完全溶解后，采用酶標儀在波長570 nm處測定吸光度，從而計算細胞存活率。

2.4 Caco-2細胞轉運模型的建立

取對數生長期的Caco-2細胞，胰酶消化，調整細胞密度至2×105個/ml，以3×105個/孔的密度接種于包被鼠尾膠原的六孔Transwell細胞培養(yǎng)板絨毛面(apical，AP)側，基底面(basolateral，BL)側加入培養(yǎng)液2.6 ml，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)液，待細胞分化形成致密的單細胞層后，用電阻儀測定跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)，取TEER>400 Ω/cm2的孔進行轉運實驗。

2.5 轉運實驗

取“2.4”項下電阻符合要求的Transwell細胞培養(yǎng)板，于AP側加入37 ℃預熱的pH為7.4的HBSS(下同)1.5 ml，BL側加入HBSS 2.6 ml，于培養(yǎng)箱中孵育20 min，棄去雙側HBSS，重復3次。在AP或BL側加入用HBSS配制的胺碘酮溶液(10、20和40 μmol/L)1.5或2.6 ml，BL或AP側加入含1% DMSO的HBSS 2.6或1.5 ml，于培養(yǎng)箱中孵育，分別于20、40、60、80、100、120 min從BL或AP側收集透過液樣品200 μl，并補充同體積接收液，每個濃度重復3個孔。為考察P-gp抑制劑維拉帕米或阿托伐他汀對胺碘酮轉運的影響，分別在AP或BL側加入含100 μmol/L維拉帕米或50 μmol/L阿托伐他汀的胺碘酮溶液(20 μmol/L)1.5或2.6 ml，余同。

2.6 含量測定

色譜條件：色譜柱Hypersil BDS C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；柱溫30 ℃；流動相2%三乙胺(用磷酸調節(jié)pH至4.8)-乙腈(V∶V=40∶60)；檢測波長240 nm；流速0.8 ml/min[10-11]。精密吸取200 μl樣品溶液，加入內標20 μl(黃體酮，20.0 μg/ml)，混勻后以轉速12 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液20 μl進高效液相色譜儀進行測定，用標準曲線法計算樣品中胺碘酮的濃度。

2.7 數據處理

3 結果

3.1 細胞毒性實驗結果

加入不同濃度胺碘酮后，經過3 h孵育，細胞的存活率見圖1，可見胺碘酮濃度<200 μmol/L時無明顯細胞毒性，細胞存活率達80%以上，后續(xù)轉運實驗時胺碘酮藥物濃度分別選取10、20和40 μmol/L。

圖1 不同濃度胺碘酮對Caco-2細胞生存率的影響Fig 1 Effects of different concentration of amiodarone on cell survival rate of Caco-2

3.2 胺碘酮轉運實驗結果

胺碘酮在不同濃度下從AP→BL及BL→AP的轉運量隨濃度的增高而相應增大，見圖2—3。不同濃度胺碘酮的雙向轉運Papp值見表1，統(tǒng)計分析結果顯示，不同濃度之間Papp值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且ER均<1.5。

圖2 不同濃度胺碘酮從AP側到BL側的轉運量Fig 2 Transport amount of different concentration of amiodarone from AP→BL

圖3 不同濃度胺碘酮從BL側到AP側的轉運量Fig 3 Transport amount of different concentration of amiodarone from BL→AP

組別Papp(×106)( x±s)AP→BLBL→APER10μmol/L胺碘酮7 03±0 536 62±0 430 9420μmol/L胺碘酮6 36±0 316 46±0 101 0240μmol/L胺碘酮7 24±0 336 50±0 100 9020μmol/L胺碘酮+維拉帕米7 06±1 086 57±0 330 9320μmol/L胺碘酮+阿托伐他汀6 85±0 486 84±0 741 00

3.3 維拉帕米和阿托伐他汀對胺碘酮轉運的影響

在存在維拉帕米或阿托伐他汀條件下，胺碘酮的Papp值見表1，統(tǒng)計分析發(fā)現，加入維拉帕米或阿托伐他汀后，胺碘酮的Papp值與不存在維拉帕米或阿托伐他汀時的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明維拉帕米或阿托伐他汀不影響胺碘酮的轉運。

4 討論

采用Caco-2細胞轉運模型研究藥物的轉運機制時，可根據藥物的ER判斷藥物的轉運類型，若ER>1.5，提示可能存在主動轉運機制；若ER<1.5，則表明以被動擴散為主。此外，如不同濃度下測得的Papp值基本保持恒定，則可間接說明其轉運不需要載體的介入，同樣表明轉運機制以被動擴散為主[12-15]。

本實驗中，胺碘酮不同濃度之間Papp值的差異無統(tǒng)計學意義，各組的ER均<1.5，且P-gp抑制劑維拉帕米對其Papp值無顯著影響，表明胺碘酮在小腸上皮細胞上的轉運機制為被動擴散。阿托伐他汀與胺碘酮合用時，胺碘酮的Papp值與單用胺碘酮時的Papp值比較，差異無統(tǒng)計學意義，表明阿托伐他汀不影響胺碘酮的吸收。

綜上所述，胺碘酮在Caco-2單層細胞模型中的轉運主要通過被動擴散形式進行，臨床聯(lián)合應用胺碘酮與阿托伐他汀時無需考慮腸吸收方面的相互作用。

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Study on Transport Mechanism of Amiodarone and Effect of Atorvastatin on Transport of Amiodarone by Caco-2 Cell Monolayer ModelΔ

KONG Lingti1, LIU Dong2, SONG Chunli1, ZHU Yulin1

(1.Dept.of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui Bengbu 233004, China; 2.Dept.of Pharmacy, Chongqing Nanchuan District People’s Hospital, Chongqing 408400, China)

OBJECTIVE：To probe into the intestinal absorption characteristics of amiodarone, and to evaluate the effects of combination of atorvastatin on intestinal absorption of amiodarone. METHODS: The apparent permeability coefficients(Papp) of amiodarone in both the apical-to-basolateral(AP→BL) and the basolateral-to-apical(BL→AP) direction were studied by using the Caco-2 cell monolayer model, the transport mechanism of membrane-disrupting were also evaluated. And the effects of verapamil and atorvastatin on the Papp value was determined. RESULTS: The bilateral transfer capacity of amiodarone increased with the ascent of concentration(10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L). There was no significant difference in Papp values of different concentrations(P>0.05), and the outside ratio were all less than 1.5. There was no obvious effects on Papp values with verapamil or atorvastatin(P>0.05), which indicated that the transport mechanism of intestinal absorption of amiodarone was passive diffusion. CONCLUSIONS: The passive diffusion is the main transport mechanism of intestinal absorption of amiodarone, and combination of atorvastatin does not affect the intestinal absorption of amiodarone.

Amiodarone; Atorvastatin; Caco-2 cell monolayer; Apparent permeability coefficient

蚌埠醫(yī)學院自然科學基金重點項目(No.BYKY1425ZD)

R96

A

1672-2124(2016)11-1472-03

2016-07-26)

*主管藥師，博士。研究方向：臨床藥理學及臨床藥學。E-mail：konglingti@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.11.009