范婭丹， 韓江全， 鄧才洪

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燈盞細(xì)辛與赤芍配伍對永久性腦缺血損傷大鼠的保護(hù)作用

范婭丹， 韓江全， 鄧才洪

目的 探討燈盞細(xì)辛與赤芍配伍藥對腦缺血性損傷大鼠的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 方法48只成年SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、腦缺血組、配伍藥物治療組、阻滯劑組，每組12只。采用線栓法制作大腦中動脈閉塞模型。于缺血后24 h后行神經(jīng)功能缺損評分，斷頭取腦行TTC染色檢測腦梗死面積，實(shí)時熒光定量PCR法、蛋白質(zhì)免疫印記法測缺血區(qū)腦皮質(zhì)SHH、Patched-1、Gli-1mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果 配伍藥物組缺損評分、腦組織梗死面積顯著低于腦缺血組和阻滯劑組。腦組織shh 、Patched-1、Gli-1 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著高于腦缺血組，阻滯劑組Gli-1mRNA及蛋白表達(dá)量顯著低于配伍藥物組。結(jié)論 燈盞乙素與芍藥苷配伍對大鼠局灶性腦缺血損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制與上調(diào)Sonic Hedgehog(Shh)通路關(guān)鍵蛋白分子表達(dá)量有關(guān)。

燈盞細(xì)辛； 赤芍； 腦缺血； 配伍

腦梗死發(fā)病率為各類腦血管疾病之首，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率的特點(diǎn)[1，2]。目前最有效的治療為溶栓和取栓[3]，但受治療時間窗和適應(yīng)證的限制，無法成為常規(guī)治療手段[4]。燈盞細(xì)辛、赤芍配伍來源于民間組方，用于治療卒中淤血阻絡(luò)證及急性腦梗死等病癥，有廣泛臨床應(yīng)用基礎(chǔ)、療效確切。但其作用機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過觀察燈盞細(xì)辛與赤芍配伍藥對腦缺血大鼠腦組織SHH、Patched-1、Gli-1 mRNA及其蛋白的表達(dá)的影響，探討燈盞細(xì)辛與赤芍配伍對腦缺血大鼠神經(jīng)的保護(hù)作用和可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 48只SPF級雄性SD(Sprague-Dawley )大鼠，8～10周齡。體重為250～280 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(粵)-2011-0015。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 燈盞細(xì)辛粗提物、赤芍粗提物及環(huán)巴胺(Cyclopamine)(上海融禾醫(yī)藥科技)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(美國 Sigma)；Gli-1兔多克隆抗體購自(美國Santa Cruz)；SHH羊多克隆抗體(美國 Santa Cruz)；Patched-1兔多克隆抗體(美國Novus Biologicals)。All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (美國GeneCopoeia)；All-in-OneTMqPCR Mix (美國GeneCopoeia)。基因序列查自美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI) 基因庫，由生工生物工程有限公司設(shè)計，在NCBI Primer-BLAST進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，引物序列由生工生物工程合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 購入動物后將所有動物按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血組、配伍藥物組、阻滯劑組。配伍藥物組與阻滯劑組于缺血后0 h、6 h分別腹腔注射配伍藥物(燈盞細(xì)辛248 mg/kg+赤芍372 mg/kg)[5]，假手術(shù)組和腦缺血組于同一時間腹腔注射等量生理鹽水。阻滯劑組于缺血前15 min腹腔注射Cyclopamine(6 mg/kg)，其他各組于同一時間腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 模型制作 購入動物后適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,采用Longa線栓法建立永久性大腦中動脈阻塞腦缺血模型。模型制作時假手術(shù)組插入線栓距頸動脈分叉處10～12 mm，其余各組大鼠插入線栓距頸動脈分叉處18±0.5 mm(插入線栓感到阻力為止)。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 參照Zea-Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn):0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。缺血后3 h進(jìn)行首次評分，評分為0分或4分的剔除(正常組0分的保留)，隨機(jī)補(bǔ)充。缺血 24 h 對各組大鼠(各組6只，共24只)進(jìn)行行為學(xué)評分并紀(jì)錄。

1.2.4 TTC染色測腦梗死面積 將已行神經(jīng)功能評分的大鼠(24只)麻醉處死后迅速斷頭取腦，于-20 ℃冰箱中速凍5 min，沿冠狀位將鼠腦切開成5片，厚度約2 mm。置于2%TTC磷酸鹽緩沖液中37 ℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定，24 h后拍照用Image J測定每張切片腦梗死面積。計算梗死面積百分比。

1.2.5 Real-time PCR檢測SHH、Patched-1、Gli-1分子的mRNA表達(dá) 大鼠(每組6只，共24只)腦缺血24 h后斷頭取腦，取缺血區(qū)腦組織用液氮在研體中碾碎后加入trizol試劑(1 ml/50～100 mg)吹打混勻后按說明書提取總RNA。檢測RNA濃度并電泳判斷核酸完整性，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并按All-in-OneTMqPCR Mix 試劑盒說明書行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。以β-Actin為內(nèi)參，采用2 -ΔΔCt法計算基因表達(dá)的差異[6]。

1.2.6 Western blod檢測SHH、Patched-1、Gli-1 蛋白含量 大鼠(與PCR實(shí)驗(yàn)共用大鼠：每組6只，共24只)腦缺血24 h后斷頭取腦，取缺血區(qū)腦組織與RIPA裂解液按1 mg∶10μl比例于冰上勻漿后按說明書提取總蛋白。取總蛋白60 μl行BCA蛋白定量法測蛋白濃度。其總蛋白按1∶1比例加入上樣緩沖液(2×)沸水中水浴5 min使其變性，SDS-PAGE電泳(上樣量為30 μg/孔)后用半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。第2天復(fù)溫1 h后TBST洗滌3次，每次15 min。相應(yīng)二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。滴加ECL發(fā)光液后用暗盒于暗室曝光。拍照后用Image J分析條帶平均灰度值。計算各組蛋白相對表達(dá)量(相對表達(dá)量=目的蛋白/內(nèi)參蛋白)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損，其余各組大鼠手術(shù)后24 h均有不同程度神經(jīng)功能缺損，各組間存在顯著性差異(見表1)。配伍藥物組神經(jīng)功能缺損評分較腦缺血組顯著減少(P<0.5)，阻滯劑組神經(jīng)功能缺損評分較配伍組顯著增加(P<0.001)。

表1 不同組別大鼠的神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分?jǐn)?shù)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與腦缺血組比較bP<0.05；與配伍藥物組比較cP<0.05

2.2 腦梗死面積 假手術(shù)組行TTC染色后未見梗死區(qū)，其余各組大鼠大腦染色均有不同范圍的白色梗死區(qū)，各組間存在顯著性差異(見表1)。配伍藥物組梗死面積百分比較腦缺血組顯著減少(P<0.05)，阻滯劑組梗死面積百分比較配伍藥物組顯著增加(P<0.05)

2.3 Real-time PCR檢測SHH、Patched-1、Gli-1分子的mRNA表達(dá)情況 實(shí)時定量PCR顯示：各組大鼠腦缺血24 h后SHH、Patched-1、Gli-1 mRNA表達(dá)水平存在顯著性差異(見表2)。與假手術(shù)組相比，腦缺血組mRNA表達(dá)水平顯著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。與腦缺血組相比，配伍藥物組mRNA表達(dá)水平顯著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。與配伍藥物組相比，阻滯劑組Gli-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(Gli-1:P<0.05)。

2.4 Western blod 檢測 SHH、Patched-1、Gli-1 蛋白含量 蛋白免疫印跡法顯示：大鼠腦缺血24 h后各組SHH、Patched-1、Gli-1蛋白表達(dá)水平存在顯著性差異(見表2)。與假手術(shù)組相比，腦缺血組各蛋白表達(dá)水平顯著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。與腦缺血組相比，配伍藥物組各蛋白表達(dá)水平顯著增高(SHH:P<0.05；Patched-1:P<0.05；Gli-1:P<0.05)。與配伍藥物組相比，阻滯劑組Gli-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

表2 不同組別大鼠腦組織的Shh、Patched-1、Gli-1 的mRNA及蛋白含量表達(dá)情況(n=6)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與腦缺血組比較bP<0.05；與配伍藥物組比較cP<0.05

3 討 論

燈盞細(xì)辛又名燈盞花、短莖飛蓬或燈盞草，為菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬[Erigeron breviscapus (Vaniot) Hand-Mazz]，以根或全草入藥。微苦，甘溫辛，性溫。歸心、肝經(jīng)。燈盞細(xì)辛主要有效成分為黃酮類和咖啡酸酯類化學(xué)物質(zhì)。燈盞細(xì)辛可通過調(diào)節(jié)腦缺血后的物質(zhì)代謝，減輕腦水腫；改善記憶學(xué)習(xí)功能；具有抗抗炎、凋亡作用[7]。赤芍又名山芍藥或草芍藥，為毛茛科芍藥屬植物赤芍(PaeoniaIactiflora Pall)、草芍藥(P.obovata Maxim)和川赤芍(P.veitchii Lynch)的根部。味苦，性微寒。歸肝經(jīng)。赤芍主要有效成分為單萜苷、多元酚類化學(xué)物質(zhì)。在缺血再灌注模型中，赤芍可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶力及其空間分辨能力；降低NO毒性損傷及細(xì)胞內(nèi)鈣超載；協(xié)同神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的神經(jīng)元突觸生長；抗血小板凝集、改善微循環(huán)[8]。民間組方燈盞細(xì)辛與赤芍配伍常用來治療卒中、偏癱，具有臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。研究表明燈盞花素和芍藥苷配伍組方合理，具有明顯的協(xié)同增效作用[9]。辛芍組方可改善腦缺血所致病理變化，增強(qiáng)病灶組織抗氧化和改善局部腦微循環(huán)血流[10]。本研究也證實(shí)燈盞細(xì)辛、赤芍組方能改善MCAO模型大鼠神經(jīng)行為功能評分，減小梗死面積，有明確的神經(jīng)保護(hù)功能。分泌蛋白Sonic Hedgehog是Hedgehog家族成員，與HH受體Ptched(12次跨膜蛋白)復(fù)合物結(jié)合。解除PTC對SMO(7次跨膜蛋白)的抑制。使轉(zhuǎn)錄因子Gli表達(dá)水平升高，Gli轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)啟動相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯[11]。SHH作為胚胎時期成形素對胚胎的發(fā)育至關(guān)重要，突變會導(dǎo)致前腦無裂腦畸形、多指(趾)、短指(趾)等[12]。SHH可維持干細(xì)胞分裂和促進(jìn)增殖基因的表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13]。在腦組織缺血方面,激活Sonic hedgehog信號通路可以通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)及下調(diào)caspase-3表達(dá)抗凋亡；調(diào)節(jié)谷胱苷肽、超氧化歧化酶、一氧化氮、乳酸脫氫酶丙二醛等表達(dá)抗氧化；促進(jìn)缺血組織血管再生和神經(jīng)修復(fù)，從而改善腦組織缺血缺氧。

本研究中，腦缺血后SHH蛋白表達(dá)增高，應(yīng)用燈盞細(xì)辛與赤芍組方治療腦缺血可使SHH信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)上調(diào)，減輕腦缺血后神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死面積。環(huán)巴胺阻斷治療組SHH信號通路，可逆轉(zhuǎn)燈盞細(xì)辛與赤芍配伍的保護(hù)效應(yīng)。表明燈盞細(xì)辛與赤芍組治療腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與增加SHH蛋白表達(dá)水平，激活SHH信號通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)可為藥物應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為下一步檢測藥物有效單體提供參考監(jiān)測指標(biāo)。但中藥多為多靶點(diǎn)作用，燈盞細(xì)辛與赤芍組方作用是否有其他作用點(diǎn)激活相關(guān)信號通路與SHH協(xié)同作用有待進(jìn)一步研究研究。

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Compatibility of erigeron breviscapus and radix paeoniae rubra protects rats against cerebral ischemic injury

FAN Yadan，HAN Jiangquan，DENG Caihong.

(Department of Neurology，the Fifth Affiliated (Zhuhai) Hospital,Zunyi Medical College,Zhuhai 519100,China)

Objective To investigate the protective effect of the compatibility of Erigeron breviscapus and Radix Paeoniae Rubra on cerebral ischemia injury rats and its possible mechanisms.Methods Forty-eight adult male Sprague-Dawley rats were divided into four groups randomly:a sham operation group,a cerebral ischemia group,a treatment group and an inhibitor group,12 in each group.MCAO model was performed according to Zea-longa’s report.Neurological deficit scores were performed after 24 h of the operation.Then decapitated the rats and took out their brain.Detected infarct size by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining,and detected the expression of the mRNA levels of Shh、Patched-1、Gli-1 by RT-PCR and assessed the proteins expression of them by Western blotting.Results The neurological deficit score and the infarct size in the treatment group were lower than that in the cerebral ischemia and inhibitors groups,both of the differences were statistically significant.RT-PCR and Western blotting suggested that the mRNA and protein levels of Shh、Patched-1、Gli-1 in the treatment group was higher than that in the cerebral ischemia group.The the GLI-1 level in the inhibitor group was lower than the treatment group．The differences were statistically significant.Conclusion The compatibility of Erigeron breviscapus and Radix Paeoniae Rubra has certain protective effect on permanent cerebral ischemia injury rats.Its mechanism was associated with the up-regulation of the expression of the key components of Sonic Hedgehog signaling pathway.

Erigeron breviscapus; Radix Paeoniae Rubra; Cerebral ischemia; Compatibility

1003-2754(2016)10-0894-03

2016-06-03；

2016-09-28

貴州省中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥課題(黔中醫(yī)藥 20141433)；珠海市重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(珠衛(wèi) 20088013)

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬珠海醫(yī)院，廣東 珠海 519100)

韓江全，E-mail：gdshanjq@ 163.com

R743.3

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