張浩楠， 鄭延澤， 何靜波， 田彩云， 武海軍， 楊玉梅

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蒙藥嘎日迪-13對腦缺血大鼠不同時相海馬中IL-1βIL-8、ICAM-1、P-selectin表達的影響

張浩楠， 鄭延澤， 何靜波， 田彩云， 武海軍， 楊玉梅

目的 觀察蒙藥嘎日迪-13對腦缺血大鼠不同時相海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達的影響。方法 360只雄性SD大鼠隨機分為腦缺血模型組、假手術組、嘎日迪-13大、中、小劑量組，每組又隨機分為6個時相組，灌胃給藥，一次/d，連續(xù)27 d后，線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，神經(jīng)功能評分后免疫組化法測定海馬IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達。結果 嘎日迪-13明顯降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分，并明顯降低腦缺血大鼠海馬IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達水平。結論 蒙藥嘎日迪-13對大鼠腦缺血有較好的保護作用，其機制可能與降低IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin等因子的表達水平有關。

蒙藥； 嘎日迪-13； 腦缺血； 大鼠； IL-1β； IL-8； ICAM-1； P-selectin

蒙醫(yī)理論認為缺血性腦血管疾病屬于白脈病范疇之內(nèi)的“薩病”，發(fā)病原因為氣血瘀滯導致血脈阻塞而使白脈之海-腦失去功能。嘎日迪-13是蒙醫(yī)常用來治療“薩病”的傳統(tǒng)方劑之一，主要由訶子、制草烏、麝香、沉香等13味藥組成，主治半身不遂、左癱右瘓、口眼歪斜、言語不清、筋骨疼痛、神經(jīng)麻痹等癥狀，療效明顯。已有的研究表明[1～3]，嘎日迪-13對腦缺血有很好的保護作用，但缺乏實驗機制的相關研究。本研究通過觀察腦缺血后大鼠海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達量，在前期研究基礎上進一步探討嘎日迪-13對腦缺血的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，雄性，清潔級，360只，體重(200±50)g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，許可證編號：SCXK(京)2011-0012。環(huán)境溫度為22 ℃～26 ℃，按每籠6只飼養(yǎng)，試驗期間各鼠均自由進行飲水攝食。

1.1.2 試劑和藥物 嘎日迪-13，內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司(金山)蒙藥廠，批號：080905； IL-1 bs-6319R，IL-8 bs-0780R，ICAM-1 bs-4615R，P-selectin bs-0561R北京博奧森；PV-6000通用型二抗試劑盒，6 ml；ZLI-9018 DAB kit 3 ml；PBS緩沖液(0.01 mol;pH=7.2～7.4)；檸檬酸鹽修復液(pH=6.0；0.01 mol)。其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 Leica 2135石蠟病理切片機，德國Leica公司；YB-7B病理組織包埋機，安徽電子科學研究所；ZT-12P生物組織自動脫水機，湖北亞光醫(yī)用電子技術有限公司；QP切片漂烘儀，安徽電子科學研究所；Leica激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司。

1.2 方法 動物分組及模型制備360只雄性SD大鼠，隨機分為：腦缺血模型組(n=72)；假手術組(n=72)；嘎日迪-13大劑量組(n=72，1.2 g/100 ml)；嘎日迪-13中劑量組(n=72，0.6g/100 ml)；嘎日迪-13小劑量組(n=72，0.3 g/100 ml)。每個劑量組下分6個時相即1 h、6 h、12 h、24 h、72 h與120 h，72只大鼠隨機分至6個時相，每個時相12只大鼠。各組大鼠均進行灌胃給藥(2 ml/100 g，模型組與假手術組給予等體積生理鹽水代替藥物)，連續(xù)27 d，一次/d，末次給藥后1 h開始造模。模型制備采用Longa[4]的線栓法加以改良制作大腦中動脈缺血模型。

1.3 取材 在規(guī)定時間點，以3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)麻醉大鼠，剪開胸壁，暴露心臟，用室溫生理鹽水通過左心尖部，沿升主動脈灌注沖血，同時剪開右心耳，可見右心耳流出液體的顏色逐漸由鮮紅色變?yōu)榈t色,至基本無色為止，換4%甲醛灌流，至大鼠肢體、尾巴僵直，即表明固定成功。開顱取腦，缺血側腦組織樣本放置于4%甲醛內(nèi)固定24 h，進行免疫組化試驗。

1.4 指標檢測

1.4.1 神經(jīng)功能評分測定 參照Longa評分標準分為5個等級：0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向外側轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)；3分：向?qū)葍A倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.4.2 免疫組化觀察腦缺血大鼠海馬不同時相IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達量 石蠟包埋，切片，65 ℃烤片1 h待用，其余步驟嚴格按照試劑盒說明書嚴格操作?？瞻讓φ找豢篂镻BS。陽性反應為細胞漿棕黃色深染，鏡下(×400)隨機觀察缺血區(qū)域不重疊的5個視野，計數(shù)各因子胞漿陽性細胞數(shù)，取平均值。

2 結 果

2.1 嘎日迪-13對腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分的影響 與假手術組比較，腦缺血模型組大鼠各時相神經(jīng)功能評分明顯升高；與腦缺血模型組比較，嘎日迪-13各組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(見表1)。

2.2 嘎日迪-13對腦缺血大鼠不同時相海馬IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達量的影響 腦缺血后1 h，模型組大鼠海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達量明顯升高(P<0.01)，并在24 h達到峰值后呈逐漸下降趨勢；與腦缺血模型組比較，嘎日迪-13組大鼠各時相海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達量明顯降低(P<0.05，P< 0.01)(見表2～表5)。

表1 嘎日迪-13對腦缺血大鼠神經(jīng)功能評分的影響±s ，n=8)

與假手術組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01

表2 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠海馬中IL-1β表達量的影響±s，n=8，ng/L)

與假手術組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01

表3 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠海馬中IL-8表達量的影響( ±s，n=8，ng/L)

與假手術組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

表4 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠海馬中ICAM-1表達量的影響±s，n=8，ng/L)

與假手術組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01

表5 嘎日迪-13在不同時相對局灶性腦缺血大鼠海馬中P-selectin表達量的影響

與假手術組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

近年來對腦缺血損傷的作用機制有了非常深入細致的研究，從整體到分子水平的大量實驗研究表明[5]，炎癥反應在缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用，炎癥反應重要的病理變化是腦微血管內(nèi)白細胞聚集變形穿越血管，然后浸潤腦組織，整個過程中還會伴有微血管循環(huán)功能障礙，腦組織水腫和血漿蛋白聚集?？梢?，白細胞與血管內(nèi)皮細胞的粘附是腦缺血炎癥損傷的開端。

粘附分子在炎癥反應起始階段介導了白細胞向血管內(nèi)皮細胞的滾動，其可分為3個家族：選擇素家族、可識別整合素的免疫球蛋白超家族成員和整合素家族。

選擇素是在血小板、血管內(nèi)皮細胞和白細胞表面表達的一種表面糖蛋白，根據(jù)表達部位不同可分成3類：P-selectin，表達于活化的血小板和內(nèi)皮細胞表面；E-selectin，表達于活化的血管內(nèi)皮細胞表面；L-selectin，表達于白細胞表面[6]。P-selectin在細胞受到刺激之后可通過質(zhì)膜融合的方式迅速表達于細胞表面，或者在4～6 h之后通過mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯再表達。大鼠MCAO再灌2～24 h均可檢測到P-selectin存在，且與白細胞-內(nèi)皮細胞粘附遷移和組織水腫形成的部位一致[7]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，血栓性疾病的早期階段血中P-selectin增高可反映體內(nèi)血小板活化程度,尤其是短暫性腦缺血發(fā)作和急性腦梗死等缺血性腦血管疾病患者[8]。

ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，生理狀態(tài)下呈低表達，其主要受體是整合素家族的CD11a/CD18。ICAM-1與其受體結合后，在介導白細胞向炎癥區(qū)移行及淋巴細胞歸巢和再循環(huán)的進程中起重要作用。有學者發(fā)現(xiàn)[9,10]，大鼠腦缺血2～6 h后，缺血區(qū)及周邊微血管內(nèi)ICAM-1表達明顯增加，至24～48 h達到峰值，其表達程度的增加比TNF-α和IL-1β稍晚[11]。近年臨床研究也發(fā)現(xiàn)，可溶性ICAM-1在急性缺血性腦病患者腦脊液和血漿中含量顯著升高,而且發(fā)現(xiàn)ICAM-1表達水平的高低與腦缺血損傷程度成正相關[12,13]。

IL-1β在缺血腦損傷過程中是重要的一個致炎因子。IL-1β是IL-1在腦組織、血漿和組織液中的一種存在形式，在其他因子協(xié)同下促進T淋巴細胞和B淋巴細胞活化，更重要的是其可誘導ICAM-1、IL-8表達上調(diào)，進一步誘導白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附、聚集加重炎癥反應程度[14]。有研究顯示，腦缺血后IL-1β可在腦組織、腦脊液和血清中檢測到異常增加[15]。腦組織、血漿和腦脊液中IL-1β表達明顯上調(diào)，提高血小板活化因子水平，改變內(nèi)皮細胞的抗凝血功能，進一步加快血栓的形成[16]。

IL-8可來源于多種細胞，是一種非常重要的趨化因子，是一類典型的炎癥介質(zhì)，其可趨化激活中性粒細胞并參與中性粒細胞與內(nèi)皮細胞粘附過程的調(diào)節(jié)[17]。IL-8及其相關趨化性多肽亦可迅速趨化活化整合素α、β鏈的連接分子，增加白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附和跨膜移行[18]，并誘導ICAM-1的表達上調(diào)。有學者發(fā)現(xiàn)[19]，大鼠腦缺血再灌3 h后，缺血區(qū)IL-8濃度升高，12 h達到峰值。臨床研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦血管疾病患者血清IL-8含量高于正常人，且大面積梗死患者血清IL-8含量高于小面積梗死患者，提示IL-8與腦缺血后損傷有關[20]。

本研究通過對大鼠神經(jīng)功能評分觀察，顯示嘎日迪-13對腦缺血具有很好的保護作用。且嘎日迪-13能夠明顯降低腦缺血大鼠各時相海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達水平。表明嘎日迪-13可在不同時相，不同靶點抑制腦缺血后白細胞遷移浸潤和炎癥反應對神經(jīng)的損傷。所以提示嘎日迪-13抑制炎癥因子和黏附因子的表達可能是其對腦缺血保護作用的機制之一。

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Influence of mongolian medicine garidi-13 on the expression of IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin at different phase of cerebral ischemic rats hippocampus

ZHANG Haonan,HENG Yanze,HE Jingbo,et al.

(Baotou Medical College,Inner Mongolia,Baotou 024000,China)

Objective To observe the influence of Mongolian Medicine Garidi-13 on the expression of IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin at different phase of cerebral ischemic rats hippocampus.Methods 360 male SD rats were randomly divided into vehicle control group,sham-operated group,Gridi-13 large dose group,Gridi-13 middle dose group and Gridi-13 small dose group,then each group was divided into the ischemia 1 h,6 h,12 h,24 h,72 h and 120 h phases.Lavage rats with Garidi-13 once a day till 27th,then established cerebral ischemia model with Suture method cerebral ischemia model.After having recorded the neurofunctional score,their brain samples were collected for immunohistochemical staining of IL-1β,IL-8,ICAM-1 and P-selectin.Result The expressions of hippocampal IL-1β,IL-8,ICAM-1 and P-selectin in the model group were significantly higher than those in vehicle group (P<0.01).According to the results of immunohistochemical staining,the Garidi-13 groups could inhibit the expression of IL-1β,IL-8,ICAM-1,P-selectin.Conclusion Garidi-13’s protective mechanism for brain tissues of cerebral ischemic rats may be related to its effects in inhibiting IL-1β,IL-8,ICAM-1,P-selectin expression.

Mongolian Medicine; Garidi-13; Cerebral Ischemic; Rats; IL-1β; IL-8; ICAM-1; P-selectin

1003-2754(2016)10-0905-04

2016-06-02；

2016-09-29

國家自然科學基金項目(No.81160560)

(包頭醫(yī)學院 藥學院，內(nèi)蒙古 包頭 014000)

楊玉梅，E-mail：yym457@aliyun.com

R743.3

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