王禎旭，車坷科，楊　帆，鄧開(kāi)英，丁家昱

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶　401121； 2.重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶　401121；　3.重慶市人民醫(yī)院，重慶　400015）

高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)陰合劑中連翹苷含量

王禎旭1，2，車坷科3，楊帆1，2，鄧開(kāi)英1，2，丁家昱3

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121； 2.重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121；3.重慶市人民醫(yī)院，重慶400015）

目的 建立測(cè)定養(yǎng)陰合劑中連翹苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，用以控制養(yǎng)陰合劑的質(zhì)量。方法 色譜柱為Waters SunFire C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸（19∶81），流速為2.0 mL／min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。結(jié)果 連翹苷進(jìn)樣量在0.021 24～0.424 8 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均加樣回收率為98.44%，RSD為1.42%（n=6）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于養(yǎng)陰合劑的質(zhì)量控制。

養(yǎng)陰合劑；連翹苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

養(yǎng)陰合劑是由連翹、玄參、黃芩、地黃等中藥經(jīng)提取制成，具有滋陰涼血、清熱解毒的功效，作為醫(yī)院制劑，臨床主要用于咽炎、咽喉腫痛等的治療，效果良好。養(yǎng)陰合劑收載于2008年版《重慶市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅收載有制法、性狀和相對(duì)密度檢查及合劑制劑通則檢查，可控性較差，有待完善。處方中連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的作用［1］，與養(yǎng)陰合劑的臨床療效直接相關(guān)。本研究中參考文獻(xiàn)［2-15］，建立了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定養(yǎng)陰合劑中連翹的活性成分連翹苷的含量，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了參考。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），HP-Chemstation色譜工作站；BP211S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Simplicity-185型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2試藥

連翹苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110821-201112，含量為91.8%）；養(yǎng)陰合劑（重慶市人民醫(yī)院，批號(hào)分別為150211，150511，151201，規(guī)格為每瓶250 mL）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters SunFire C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（19∶81）；流速：2.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，供試品溶液中連翹苷色譜峰分離良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　高效液相色譜圖

2.2溶液制備

稱取連翹苷對(duì)照品0.014 46 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液；精密量取養(yǎng)陰合劑2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置1 h，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。另取按處方比例制備的缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取陰性對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，在與連翹苷對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1，5，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=2 622.0X+11.3，r=0.9999（n=5）。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在0.02124～0.424 8 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄峰面積。結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為0.53%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為151201）樣品適量，混勻，分別按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，依法進(jìn)樣測(cè)定連翹苷含量。結(jié)果連翹苷含量的 RSD為1.51%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取新制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h時(shí)各進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為1.13%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的同一批（批號(hào)為151201）樣品1 mL，共6份，分別置25 mL容量瓶中，精密加入連翹苷對(duì)照品甲醇溶液（質(zhì)量濃度為0.204 g／L）1 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　連翹苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4樣品含量測(cè)定

按擬訂含量測(cè)定方法測(cè)定3批養(yǎng)陰合劑的含量，結(jié)果3批樣品中每1 mL含連翹苷的量分別為0.25，0.22，0.21 mg。

3　討論

2015年版《中國(guó)藥典（一部）》連翹項(xiàng)下連翹苷的含量測(cè)定中流動(dòng)相采用乙腈-水（25∶75），檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，文獻(xiàn)［2-9］報(bào)道的中藥復(fù)方制劑中連翹苷含量測(cè)定也大多使用此條件。另外還報(bào)道了的流動(dòng)相有乙腈-磷酸鹽緩沖液［10］、乙腈 -0.2%磷酸溶液［11］、乙腈-0.4%磷酸溶液［12］、乙腈-0.2%醋酸溶液［13］、甲醇-水［14］、甲醇-0.2%磷酸［15］等。本研究中比較了乙腈-水和乙腈-0.2%磷酸兩種流動(dòng)相，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81）時(shí)，樣品中連翹苷色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

連翹苷分別在230nm和277nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且230 nm波長(zhǎng)處的吸收較277 nm強(qiáng)。經(jīng)比較，并結(jié)合養(yǎng)陰合劑中連翹苷含量的實(shí)際情況，選擇230 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，保證了樣品中連翹苷測(cè)定的吸收靈敏度，且相鄰成分互不干擾。經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)，樣品中連翹苷色譜峰與連翹苷對(duì)照品色譜峰紫外（UV）光譜一致。

在供試品溶液的制備中，分別以50%乙醇和甲醇稀釋樣品，兩者均能起到醇沉作用，能除去樣品中的部分雜質(zhì)，然后取上清液經(jīng)濾過(guò)后進(jìn)樣，色譜峰分離情況均較好，且甲醇的雜質(zhì)峰更少。經(jīng)考察，樣品加甲醇稀釋搖勻后靜置1 h，即可使樣品基本沉淀完全，再取上清液濾過(guò)即可。

本研究中采用3支不同廠家生產(chǎn)的色譜柱對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果樣品中連翹苷的色譜峰均達(dá)到基線分離，連翹苷含量檢測(cè)結(jié)果一致，方法耐用性良好。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：170.

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Content Determination of Phillyrin in Yangyin Mixture by HPLC

Wang Zhenxu1，2，Che Keke3，Yang Fan1，2，Deng Kaiying1，2，Ding Jiayu3
（1.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing，China401121；2.Chongqing Engineering Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Chongqing，China401121；3.Chongqing General Hospital，Chongqing，China400015）

ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of phillyrin in Yangyin Mixture to provide a quality control methods for it.MethodsThe Waters SunFireC18column（150 mm×4.6 mm，5 μm） was used with the mobile phase of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（19∶81）withtheflowrateof2.0 mL／min.The column temperature was 30℃，and the detection wavelength was set at 230 nm.ResultsThelinear rangeofphillyrinwas0.021 24-0.424 8 μg（r=0.999 9）.The average recovery was 98.44%with the RSD of 1.42%（n=6）.ConclusionThe method is simple，rapid and accurate，and can be used for the quality control of Yangyin Mixture.

Yangyin Mixture；Phillyrin；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2016）20-0055-03

王禎旭，男，工程師，研究方向?yàn)樗幤贰⒈＝∈称泛突瘖y品質(zhì)量檢測(cè)和控制方法，（電子信箱）35668808＠qq.com；車坷科，男，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑、藥物新劑型與新技術(shù)，本文通訊作者，（電子信箱）beayerchoe＠163.com。

（2016-06-11；

2016-07-21）