蔣承耿+瞿鴻飛+王忠宇

摘要：從貴州六盤(pán)水煙區(qū)采集感病煙株，采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離純化，并將培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以南江3號(hào)煙草品種為試材，進(jìn)行病原菌致病性測(cè)定。結(jié)果表明，該菌培養(yǎng)最適NaCl濃度4%，葡萄糖濃度10%，pH值5～7，培養(yǎng)溫度25～30℃，最佳侵染溫度20～25℃，相對(duì)濕度70%以上，該病害應(yīng)屬于中溫高濕侵染病害。

關(guān)鍵詞：煙草；病原菌；分離培養(yǎng)；致病性

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）11-0072-04

Abstract The isolation and purification of pathogen of a tobacco bacterial disease was conducted from tobacco-growing areas in Liupanshui of Guizhou Province using the issue separation method. Its culture conditions were optimized， and the pathogenicity was measured with Jiangnan 3 as material. The results showed that the optimum growth conditions of this pathogen were 4% of salt concentration， 10% of sugar concentration， 5 to 7 of pH value， and 25～30℃ of cultivation temperature. And the best infesting conditions of this pathogen were 20～25℃ of infesting temperature， and more than 70% of relative humidity. Thus， the disease was easy to infection under middle temperature and high humidity conditions.

Keywords Tobacco； Pathogen； Isolation and culture； Pathogenicity

煙草作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展得到廣泛關(guān)注[1]。而煙草細(xì)菌性病害是威脅煙草生產(chǎn)的主要病害之一，其發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重，嚴(yán)重影響著煙草的質(zhì)量和產(chǎn)量，進(jìn)而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益極大受損。已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌性病害有青枯病、細(xì)菌性角斑病、野火病、空莖病、細(xì)菌性黑桿病等[2-8]。余磊等于2004年報(bào)道了云南文山州西疇縣和保山市昌寧縣發(fā)現(xiàn)1種由細(xì)菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）侵染引起的煙草新病害[1]。2007年，筆者在貴州省盤(pán)縣煙區(qū)忠義、保田發(fā)現(xiàn)一種煙草未知病害，該病害在忠義鄉(xiāng)開(kāi)始零星發(fā)生，主要為害煙株中下部葉片葉柄，造成葉片呈水浸狀腐爛，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，煙株中下部莖稈與葉柄連接處開(kāi)始出現(xiàn)水浸狀斑點(diǎn)，最后呈潰瘍狀腐爛，2009年發(fā)生面積達(dá)60多公頃，重病田塊病株率達(dá)100%，嚴(yán)重田塊造成絕收，2010年發(fā)生面積增大，有逐漸蔓延趨勢(shì)，嚴(yán)重制約著該地區(qū)烤煙生產(chǎn)。本試驗(yàn)對(duì)該病的病原菌進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化及致病性測(cè)定，以明確其生物學(xué)特性，為病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草品種 從盤(pán)縣忠義發(fā)病煙田采回發(fā)病煙葉及莖稈（品種：南江3號(hào)），室內(nèi)接種鑒定品種南江3號(hào)。

1.1.2 主要試劑 牛肉膏 （北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司）； 蛋白胨 （北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）；瓊脂 （福建莆田市聯(lián)邦瓊脂有限公司）； NaCl （重慶川江化學(xué)試劑廠）。

1.1.3 培養(yǎng)基配方 NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，瓊脂 20.0 g，pH 6.8～7.0，加水定容到1 000 mL，121℃濕熱滅菌20 min。

JNFb培養(yǎng)基：DL-蘋(píng)果酸5 g·L-1、K2HPO4 0.6 g·L-1，KH2PO4 1.8 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，CaCl2·H2O 0.2 g·L-1，F(xiàn)eEDTA 0.066 g·L-1，溴香酚藍(lán)指示劑2 mL，微量元素2 mL，KOH 4.5 g·L-1，pH 5.8，固體培養(yǎng)基加入瓊脂17 g。微量元素成分如下：Na2MoO4·2H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.235 g，H3BO3 0.28 g，CuSO4·5H2O 0.008 g，ZnSO4·7H2O 0.024 g，溶于200 mL蒸餾水中。

1.2 病原菌的分離純化

病原菌分離參照伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)[9]及饒小麗試驗(yàn)方法[10]。將病株莖稈表面用清水洗凈晾干，再用85%酒精擦拭，迅速過(guò)火燒盡酒精，用消過(guò)毒的解剖刀刮去表面皮層，刮其褐色組織，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，滴入2滴無(wú)菌水，用無(wú)菌玻棒搗碎組織，靜置5 min，用玻棒取搗碎組織液在NA培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落后，挑取小圓形、稍隆起、白色稀湯狀、有光澤菌落于NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，純化3～4次，然后再挑取單一菌落，置于裝有10 mL無(wú)菌水的試管中，保存菌種備用。

1.3 病原菌菌懸液制備

用滅菌接種環(huán)蘸取1.2中純化菌種，在NA培養(yǎng)基上劃線，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。待病原菌在NA培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后，取病原菌于3 mL無(wú)菌水中配制成菌原液，經(jīng)系列稀釋?zhuān)渲茲舛燃s1×108 cfu·mL-1的病原菌懸浮液。

1.4 菌體培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.1 菌株耐鹽性試驗(yàn) 在JNFb培養(yǎng)基中加入NaCl調(diào)節(jié)鹽濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，以不加NaCl為對(duì)照。每處理重復(fù)3皿，每皿接種1×106 cfu·mL-1濃度病原菌懸浮液2 mL，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀測(cè)細(xì)菌數(shù)量，以測(cè)定細(xì)菌耐鹽性。

1.4.2 菌體最適糖濃度試驗(yàn) 在鹽濃度為4%的JNFb培養(yǎng)基中分別加入5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%葡萄糖，以不加葡萄糖為對(duì)照。每處理重復(fù)3皿，每皿接種1×106cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀測(cè)細(xì)菌數(shù)量，以測(cè)定最適生長(zhǎng)糖濃度。

1.4.3 菌體最適生長(zhǎng)酸堿度試驗(yàn) 在鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%的JNFb培養(yǎng)基中采用鹽酸和氫氧化鈉將pH值分別調(diào)為3、4、5、6、7、8、9、10。每處理重復(fù)3皿，每皿接種1×106cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀測(cè)細(xì)菌數(shù)量，以測(cè)定菌體最適生長(zhǎng)酸堿度。

1.4.4 菌體最適培養(yǎng)溫度試驗(yàn) 在鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值調(diào)為5～7的JNFb培養(yǎng)基中每皿接種1×106 cfu·mL-1病原菌懸浮液2 mL，置于在5、10、15、20、25、30、35、40、45℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)中。每處理重復(fù)3皿，24 h后觀測(cè)細(xì)菌數(shù)量，以測(cè)定最適培養(yǎng)溫度。

1.5 病原菌致病條件

1.5.1 接種濃度試驗(yàn) 調(diào)節(jié)JNFb液體培養(yǎng)基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5～7，接種致病菌菌懸液，接種濃度設(shè)為1×10、1×102、1×103 、1×104、 1×105、1×106、1×107、1×108 cfu·mL-1，另設(shè)清水對(duì)照（CK），共9個(gè)處理。每處理重復(fù)3盆，苗齡40～50 d，接種后常溫培養(yǎng)，每天觀察致病情況。

1.5.2 致病溫度試驗(yàn) 調(diào)節(jié)JNFb液體培養(yǎng)基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5～7，致病菌菌懸液接種濃度1×108 cfu·mL-1，接種后置于15、20、25、30、35℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相對(duì)濕度為75%，共5個(gè)處理，每處理重復(fù)3盆，苗齡40～50 d，每天觀察致病情況。

1.5.3 致病濕度試驗(yàn) 調(diào)節(jié)JNFb液體培養(yǎng)基鹽濃度為4%、葡萄糖濃度為10%、pH值為5～7，致病菌菌懸液接種濃度1×108 cfu·mL-1，苗齡40～50 d，接種，置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，濕度設(shè)50%、60%、70%、80%、90%共5個(gè)處理，每處理重復(fù)3盆。每天觀察致病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌培養(yǎng)條件

2.1.1 病原菌耐鹽性 在一定鹽濃度范圍內(nèi)，該菌生長(zhǎng)量隨鹽濃度增加而增大，在含4%NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量達(dá)到最大，而后降低，在鹽濃度10%時(shí)已不能再生長(zhǎng)。表明，所分離到的細(xì)菌耐鹽性最大不能超過(guò)10%，最適生長(zhǎng)鹽濃度為4% （圖1） 。

2.1.2 病原菌培養(yǎng)最適葡萄糖濃度 在不含葡萄糖培養(yǎng)基中，菌體能生長(zhǎng)；隨著培養(yǎng)基含糖量增加，菌體生長(zhǎng)量增大，在含糖量10%時(shí)，生長(zhǎng)最為旺盛，而后，隨含糖量增加，菌體生長(zhǎng)量減少，在含糖量達(dá)到35%時(shí)，菌體依然能夠生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)量較?。▓D2） 。

2.1.3 病原菌培養(yǎng)最適pH值 目標(biāo)菌在pH 3～10較大范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，在pH 5～7之間有較高生長(zhǎng)量，當(dāng)pH值為6時(shí)最適合菌體生長(zhǎng)（圖3）。

2.1.4 病原菌培養(yǎng)最適溫度 低于10℃的環(huán)境下菌株不能生長(zhǎng)；至15℃時(shí)，菌株有少量生長(zhǎng)，隨著溫度升高，生長(zhǎng)量增大，在30℃生長(zhǎng)量最大；然后隨溫度升高生長(zhǎng)量降低，到40℃時(shí)依然有少量生長(zhǎng)；到45℃時(shí)，菌株都不能再生長(zhǎng)（圖4）。

2.2 病原菌致病條件

2.2.1 最佳接種濃度 1×10、1×102 cfu·mL-1和1×103 cfu·mL-1三個(gè)濃度處理未出現(xiàn)過(guò)敏性反應(yīng)；1×104 cfu·mL-1和1×105 cfu·mL-1兩個(gè)濃度處理在接種后5～6 d出現(xiàn)輕微反應(yīng)，在接種周?chē)憩F(xiàn)葉肉黃化；1×106、1×107 cfu·mL-1和1×108 cfu·mL-1三個(gè)濃度處理3～4 d在接種周?chē)憩F(xiàn)葉肉黃化，7 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死；對(duì)照未出現(xiàn)異常反應(yīng)。表明，最佳接種濃度在1×106 cfu·mL-1以上，隨濃度增加，致病性反應(yīng)加強(qiáng)。

2.2.2 最適致病溫度 在15℃時(shí)接種后7 d出現(xiàn)接種周?chē)~肉黃化，10 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死；20℃接種后3 d出現(xiàn)致病性反應(yīng)，接種周?chē)~肉黃化，10 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死；25℃接種后第3 d出現(xiàn)致病性反應(yīng)，接種周?chē)~肉黃化，7 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死；30℃接種后第4 d出現(xiàn)致病性反應(yīng)，接種周?chē)~肉黃化，7 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死；35℃接種后5 d出現(xiàn)接種周?chē)~肉黃化，10 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死。表明，在75%相對(duì)濕度下，最適侵染溫度在20～25℃。

2.2.3 最適侵染濕度 在25℃條件下， 50% RH處理接種后未出現(xiàn)侵染現(xiàn)象；60%RH處理接種后5 d出現(xiàn)接種周?chē)~肉黃化，6 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死； 70% RH處理接種后3 d出現(xiàn)接種周?chē)~肉黃化，5 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死； 80%、90% RH處理接種后2 d出現(xiàn)接種周?chē)~肉黃化，4 d葉柄邊緣表現(xiàn)壞死。表明，最適侵染濕度應(yīng)在70%以上，屬于高濕侵染病害。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌培養(yǎng)最適NaCl濃度為4%，葡萄糖濃度為10%，pH為 5～7，最適培養(yǎng)溫度在25～30℃之間。菌株最適侵染濃度在1×106 cfu·mL-1以上，最適侵染溫度在20～25℃之間，相對(duì)濕度在70%以上侵染速度快，因此該病害應(yīng)屬于中溫高濕侵染病害。

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