閆榮榮

(太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008)

?

纖維素分解菌的分離選育

閆榮榮

(太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008)

以含腐草的土壤為樣品，通過土樣稀釋，選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)初篩，將初篩選擇出的菌株在CMC-Na培養(yǎng)基上進(jìn)行多次復(fù)篩，通過剛果紅染色觀察透明圈，CMC糖化力法測纖維素酶活力進(jìn)一步篩選，選擇出1菌株與15菌株為該次實(shí)驗(yàn)的優(yōu)良菌株。

纖維素；分解菌；分離；選育

纖維素是地球上最豐富的生物多聚物，是一種巨大的可利用再生資源。但由于纖維素特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對于其利用仍然十分有限。其中，尤以農(nóng)作物秸稈為甚，我國年產(chǎn)秸稈約6億t，目前僅有20%的纖維素被開發(fā)利用，主要用作燃料、堆肥與牲畜飼料等，甚至因無法利用而被廢棄，這樣，不僅浪費(fèi)資源，而且會對環(huán)境產(chǎn)生不利影響。纖維素的高效資源利用得力于纖維素的分解，但由于生產(chǎn)纖維素酶的成本很高，從而阻礙了纖維素酶水解的實(shí)際應(yīng)用[1]。因此，篩選出具有高活性纖維素酶的纖維素分解菌對纖維素的利用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品為某學(xué)院富含纖維素分解菌的草坪土壤。

1.2 培養(yǎng)基

1) 剛果紅-纖維素培養(yǎng)基：剛果紅0.2 g，磷酸氫鉀0.5 g，微晶纖維素2.0 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸銨2.0 g，瓊脂14.0 g，去離子水1 000 mL。觀察纖維素分解菌透明水解圈大小。

2) CMC培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，磷酸氫鉀0.5 g，酵母膏1.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂3.0 g，硝酸銨1.0 g，1 000 mL的無菌水并于121 ℃滅菌20 min。

3) 產(chǎn)酶培養(yǎng)基：磷酸二氫鈉3.0 g，硫酸銨2.0 g，尿素0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈣0.5 g，七水硫酸亞鐵7.5 mg，一水硫酸錳2.5 mg，硫酸鋅2.0 mg，羧甲基纖維素鈉10 g，蛋白胨1 g，酵母膏10 g，瓊脂3.0 g，1 000 mL的無菌水并于121 ℃滅菌20 min。

4) 肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，1 000 mL的無菌水并于121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集與稀釋

1) 在校園綠化區(qū)內(nèi)挖取含腐草根與腐質(zhì)葉的土壤作為樣品。

2) 腐質(zhì)土壤樣品稀釋溶液的制備：稱取10 g草地中含腐草根的土壤放入帶玻璃珠的90 mL瓶裝無菌水中，機(jī)械振蕩20 min，使土樣分散。

3) 用梯度稀釋法對土樣懸液進(jìn)行系列稀釋。

1.3.2 纖維素分解菌的篩選分離

1) 初篩：將稀釋的土樣懸液利用無菌接種槍吸取0.2 mL樣品稀釋液于滅過菌的初篩分離平板上，涂布，28 ℃～29 ℃培養(yǎng)7 d。

2) 復(fù)篩：再將初篩出的菌株通過劃線接種于CMC-Na平板上，28 ℃～29 ℃培養(yǎng)3 d，進(jìn)行增殖。

3) 剛果紅染色：將增殖后的菌株用劃線法接種于CMC-Na平板上，28 ℃～29 ℃培養(yǎng)3 d后，用剛果紅進(jìn)行染色5 min，染色完成后傾去染液測溶解圈直徑。

4) 富集：以復(fù)篩出的生長快、紅色濃郁、透明溶解圈較大的混菌株為對象，將其劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28 ℃～29 ℃培養(yǎng)2 d，如此反復(fù)多次，進(jìn)行分離，保存。

5) 提取粗酶液：將分離得到的菌株分別接種到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃～29 ℃振蕩培養(yǎng)5 d。然后，在4 000 r/min離心速度下，離心5 min，取上清液作為粗酶液。

1.4 纖維素酶活的測定

取20 mL刻度試管，加入酶液0.5 mL和醋酸緩沖溶液(0.1 mol/L、pH=4.6)，搖勻。加入CMC-Na溶液1.5 mL，40 ℃水浴保溫30 min后，馬上加入1.5 mL DNS顯色劑，沸水水浴5 min，取出冷卻后，定容至20 mL，在波長540 nm處測得吸光度As。設(shè)置空白對照組。酶活力的計算公式如式(1)。

酶活力(u/g)=P×K×1 000/0.5×30

(1)

式中：P為葡萄糖體積分?jǐn)?shù)，%；K為稀釋倍數(shù)，倍。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素分解菌的篩選結(jié)果

從含腐草根與腐質(zhì)葉的土壤經(jīng)過數(shù)次初篩培養(yǎng)基與復(fù)篩培養(yǎng)基的培養(yǎng)篩選，挑選出16株菌種并測定其生長速率，結(jié)果見表1。

表1 剛果紅染色后菌種在平板上的生長情況

平均生長率數(shù)值較大，則溶解圈出現(xiàn)時間相對較早，其直徑也相對較大[2-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取平均生長率為0.20以上的菌株，編號為1、6、10、13、14和15的菌株。

2.2 CMC酶活力篩選

將復(fù)篩出的1、6、10、13、14和15菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，制成菌懸液并測定其吸光度，在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出對應(yīng)還原糖的量，計算其纖維素酶活力。結(jié)果見表2。

表2 篩選菌株CMC酶活力表

由表2可知，纖維素產(chǎn)酶曲線的高峰期一般出現(xiàn)在培養(yǎng)的第3 d與第4 d。菌株1和菌株15擁有最高纖維素酶活力，分別達(dá)到4.85U和4.69U，峰值都出現(xiàn)于培養(yǎng)的第3 d。菌株10與菌株14相對而言較為特別，該2株菌株峰值出現(xiàn)在第4 d，說明其產(chǎn)酶較于其他菌株較晚。菌株6纖維素酶活力最弱。所以選擇菌株1和菌株15為最終優(yōu)良菌株。

2.3 菌株形態(tài)觀察

在雙目顯微鏡下觀察篩選出的菌株為球菌，通過革蘭氏染色顯示為紫色，所以該菌株為革蘭氏陽性菌。

3 結(jié)論

1) 從纖維素分解菌含量較多的含腐草土壤中采樣，利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行初篩、復(fù)篩和剛果紅染色，選出透明圈較大的菌株菌1、6、10、13、14、15，通過CMC酶活力測定選出1菌株和15菌株為產(chǎn)酶優(yōu)良菌株。

2) 經(jīng)雙目顯微鏡觀察該菌株為球菌，革蘭氏染色為陽性。

[1] 李日強(qiáng)，王愛英，孔令冬，等.一株纖維素分解菌的分離選育[J].山西大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006,29(3):317-320.

[2] 馮健玲，姚曉華，韋秉興，等.一株纖維素分解菌的初步鑒定及酶活檢測[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(1):329-330.

[3] 石偉.高產(chǎn)纖維素霉菌的篩選及其在青貯飼料中的應(yīng)用研究[D].西安：西北大學(xué),2008.

[4] 聶麥茜，劉加昌，朱玉璽，等.纖維素降解菌篩選分離與CMC酶提取及其活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(9):7956-7958.

Isolation and screening of cellulose decomposing bacteria

YAN Rongrong

(Department of Environmental and Safety Engineering, Taiyuan Institute of Technology, Taiyuan Shanxi 030008, China)

Taking soil containing rotten grass as samples, through the soil sample dilution,the selected strains in CMC Na by culturing on a preliminary screening medium are screened for many times.The strains coded as 1 and 15 are finally identified as the effective strains of the experiments by congo red staining observation of transparent circle and CMC saccharifying power measuring cellulose enzyme vigor.

cellulose; decomposing bacteria; isolation; screening

2016-07-11

閆榮榮，女，1981年出生，2006年畢業(yè)于太原理工大學(xué)，碩士學(xué)位，助教，主要從事水體污染處理研究工作。

科研與開發(fā)

10.16525/j.cnki.cn14-1109/tq.2016.05.11

X172

A

1004-7050(2016)05-0038-02