李 華, 王曉紅

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顏生膠囊中阿魏酸的定性鑒別與含量測定

李 華, 王曉紅

目的 對顏生膠囊中阿魏酸進(jìn)行定性鑒別與含量測定。方法 采用薄層色譜法鑒別當(dāng)歸、川芎及阿魏酸，采用高效液相色譜法測定阿魏酸含量。色譜條件：色譜柱Kromasi1 5u 100A C18，250 mm×460 mm，流動相：甲醇-1%冰乙酸溶液(30∶70)，室溫，檢測波長320 nm。結(jié)果 定性薄層鑒別結(jié)果表明，采用硅膠G薄層，以環(huán)己烷-二氯甲烷-冰乙酸(16∶16∶2)為展開劑，在365 nm紫外燈下檢視，斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾；含量測定方法學(xué)研究表明，其他成分對阿魏酸測定無干擾，阿魏酸在0.25～1.50 μg/μl濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r=0.9995)，精密度良好，對照品溶液及供試品溶液RSD分別為0.35%、0.73%，平均加樣回收率99.22%，RSD為1.4%，供試品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)論 該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以作為顏生膠囊中當(dāng)歸、川芎的質(zhì)量控制方法。

薄層色譜法；高效液相色譜法；顏生膠囊；阿魏酸

顏生膠囊是由五味子、柏子仁、炒棗仁、夜交藤、紅花、決明子、大黃、丹參、當(dāng)歸、川芎、何首烏、黃芪、威靈仙、火麻仁組成的復(fù)方制劑，用于養(yǎng)心安神、活血調(diào)經(jīng)、潤腸通便、養(yǎng)顏駐容。本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法和高效液相色譜法對顏生膠囊的主藥當(dāng)歸、川芎及其中的阿魏酸進(jìn)行定性鑒別與含量測定，以控制制劑質(zhì)量，保證臨床療效。

1 儀器與試劑

1.1 主要設(shè)備 三用紫外分析儀(天津天光光學(xué)儀器有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)，高效液相色譜儀(島津SCL-10AVP，SPD-10AVP，CAT.NO.228-40000-38)，色譜柱(Kromasi1 5u 100A C18，250 mm×460 mm)、電子天平(AL204和AB135-S)。

1.2 藥材 五味子，柏子仁，炒棗仁，夜交藤，紅花，決明子，大黃，丹參，當(dāng)歸，川芎，何首烏，黃芪，威靈仙，火麻仁；顏生膠囊(武警內(nèi)蒙古總隊(duì)醫(yī)院提供)；阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究所，編號110773-201313，SYD-14YX)。

1.3 化學(xué)試劑 乙醚、甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、環(huán)己烷(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、冰乙酸(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)、二氯甲烷(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)、稀鹽酸(天津市化學(xué)試劑三廠)、碳酸氫鈉、碳酸鈉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；硅膠(青島裕民源硅膠試劑廠)，羧甲基纖維素鈉(沈陽化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 薄層板的制備 取5 g硅膠G與0.5%CMC-Na的濾液按1∶3比例混合。研磨均勻后，涂布于玻璃板上(10 cm×15 cm或20 cm×20 cm)，厚度為0.25 mm，室溫干燥后，置烘箱中于105 ℃活化30 min，置干燥器中，放冷，備用[1]。

2.1.2 阿魏酸的提取分離方法

方法a：取當(dāng)歸對照藥材粉末和川芎對照藥材粉末各2 g，加1%碳酸氫鈉溶液50 ml，超聲處理20 min，離心15 min，取上清液用稀鹽酸調(diào)pH至2～3，用乙醚振搖提取2次，每次20 ml，合并乙醚液，分別點(diǎn)樣10 μl，展開。

方法b：取當(dāng)歸對照藥材粉末和川芎對照藥材粉末各2 g，加5%碳酸鈉溶液30 ml，超聲處理40 min，濾液用乙醚萃取，棄乙醚層，用稀鹽酸調(diào)pH值至1～2，再用乙醚提取3次，每次15 ml，合并乙醚液，分別點(diǎn)樣10 μl，展開。

方法c：取當(dāng)歸對照藥材粉末和川芎對照藥材粉末各2 g，加稀鹽酸80 ml于500 ml燒杯中。超聲處理40 min后，離心15 min，取上清液，用乙醚提取2次每次20 ml，合并乙醚液，分別制得當(dāng)歸(上)川芎(上)；殘?jiān)由倭克芙?，用稀鹽酸調(diào)pH至2左右，乙醚萃取3次(30 ml, 20 ml, 20 ml)，合并乙醚液，分別制得當(dāng)歸(下)、川芎(下)，同法制備顏生膠囊供試液，分別點(diǎn)樣10 μl，展開。

方法d：取當(dāng)歸對照藥材粉末和川芎對照藥材粉末各2 g，置于錐形瓶中，加甲醇適量，超聲30 min，分取甲醇液，水浴蒸干。殘?jiān)由倭克芙?。用稀鹽酸調(diào)pH至2左右，乙醚萃取3次(30 ml, 20 ml, 20 ml)。合并萃取液，回收乙醚，殘?jiān)蒙僭S甲醇溶解，得對照藥材溶液，分別點(diǎn)樣10μl，展開。

2.1.3 對照品、顏生膠囊供試液、陰性對照的制備 精密稱取阿魏酸對照品5.4 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。即得54 μg/ml阿魏酸的對照品溶液。將顏生膠囊以及去掉含有阿魏酸的當(dāng)歸、川芎兩味藥材的陰性對照制劑，分別按方法d制作，得到顏生膠囊樣品溶液、陰性對照溶液。2.1.4 薄層色譜條件 照薄層色譜法試驗(yàn)[2]，分別吸取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、當(dāng)歸對照藥材溶液、川芎對照藥材溶液、顏生膠囊樣品溶液、陰性對照溶液各10 μl，點(diǎn)于薄層板上，將點(diǎn)樣后的薄層板置于環(huán)己烷-二氯甲烷-冰乙酸(16∶16∶2)為展開劑的飽和層析缸內(nèi)飽和1.0 h，展開，置365 nm紫外燈下檢視。

2.1.5 提取分離方法篩選結(jié)果 圖1-A中，以方法a提取當(dāng)歸與川芎對照藥材后，斑點(diǎn)可以分開；圖1-B中，以方法b提取后的當(dāng)歸、川芎對照藥材與對照品阿魏酸相應(yīng)位置斑點(diǎn)不明顯；圖1-C以方法c提取的樣品，點(diǎn)樣展開后，發(fā)現(xiàn)在殘?jiān)幸灿邪⑽核?；圖1-D中，以方法d提取的樣品在顏生膠囊樣品與當(dāng)歸、川芎對照藥材、阿魏酸對照品相應(yīng)位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)。故以方法d作為樣品中阿魏酸的提取分離方法。

圖1 不同提取分離方法薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品精密稱取5.03 mg，加甲醇溶解，超聲30 min，甲醇定容至100 ml，搖勻，濃度為50.3 μg/ml，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取顏生膠囊10粒，去囊殼，混勻，精密稱取內(nèi)容物2 g，置錐形瓶中，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，分取甲醇液，水浴蒸干，殘?jiān)?0 ml水溶解，并用稀鹽酸調(diào)pH 1～2，置分液漏斗中，用乙醚萃取3次(30 ml、20 ml、20 ml)，合并乙醚萃取液回收乙醚至干，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜?5 ml，得供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 流動相為甲醇-1%冰乙酸水溶液(30∶70)；等度洗脫，保留時間20.465 min，流速1 ml/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μl，檢測波長320 nm。理論塔板數(shù)按阿魏酸峰計不低于3000。

2.2.4 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按顏生膠囊處方和制法，制備缺當(dāng)歸和川芎陰性制劑，精密稱取2 g，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。進(jìn)樣20 μl測定，結(jié)果陰性樣品在阿魏酸相同位置處無色譜峰，表明對阿魏酸測定無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 顏生膠囊高效液相色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品儲備液(5.00 mg/100 ml)，分別在25 ml容量瓶中稀釋成0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 μg/μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程Y=131443X+451980，r=0.9995(n=3)，結(jié)果表明，阿魏酸在0.25～1.50 μg/μl濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度 精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μl，分別重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果見表1，按上述色譜條件測定，阿魏酸峰面積積分值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.35%、0.73%，結(jié)果表明，精密度良好，顏生膠囊供試品與阿魏酸對照品組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，在0、1、2、4、6 h進(jìn)樣，共進(jìn)樣5次，按上述色譜條件分別測定，結(jié)果見表2，RSD為1.6%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 含量測定 取供試品5粒，分別定容至25 ml容量瓶中，按“2.2.3”條件測定，5粒的含量分別為0.114、0.115、0.117、0.116、0.113 mg/粒，平均含量0.115 mg/粒，RSD為1.4%。

2.2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品1.0 g，精密稱定，加入等量的阿魏酸對照品，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制備，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表3，平均回收率為99.22%，RSD為1.4%。

表3 阿魏酸對照品加樣回收率實(shí)驗(yàn)

3 討 論

3.1 顏生膠囊定性鑒別與含量測定指標(biāo)的選擇 顏生膠囊是由當(dāng)歸、川芎、紅花、丹參、何首烏、黃芪、五味子、柏子仁、炒棗仁、夜交藤、決明子、大黃、威靈仙、火麻仁組成的復(fù)方制劑，方中川芎與當(dāng)歸為君藥，二者均含有阿魏酸成分。2015版藥典[3]中，川芎僅以對照藥材薄層色譜作為其鑒別的方法，當(dāng)歸以對照藥材和阿魏酸的薄層色譜作為其鑒別方法，同時以高效液相色譜法作為其阿魏酸定量的指標(biāo)。因此，在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，選擇當(dāng)歸、川芎對照藥材和阿魏酸作為定性成分，阿魏酸作為定量指標(biāo)成分。

3.2 顏生膠囊中阿魏酸提取方法篩選 關(guān)于阿魏酸薄層色譜的研究較多[4，5]，將藥材用碳酸氫鈉、碳酸鈉提取，酸化后萃取，得到阿魏酸較少，即使點(diǎn)樣濃度很大，在對照品色譜相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)很淺，酸液提取也得不到大量的阿魏酸。本研究經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采取方法d，可以測到其中的阿魏酸，且斑點(diǎn)清晰明亮、現(xiàn)象明顯。此結(jié)果說明利用方法d可以有效地提取出顏生膠囊中的阿魏酸，且此方法操作簡便、穩(wěn)定。

3.3 流動相系統(tǒng) 2015版藥典[3]中，當(dāng)歸中阿魏酸含量測定選用的流動相系統(tǒng)是乙腈-0.085%磷酸(17∶83)；秦龍等[6]以甲醇-0.5%冰乙酸溶液(34∶66)為流動相，測定當(dāng)歸保肝膠囊中阿魏酸；顧秀琰等[7]測定當(dāng)歸、川芎不同配比中阿魏酸的含量測定時,以乙腈-0.085%磷酸水溶液(17∶83)為流動相，顏生膠囊中除當(dāng)歸、川芎外，還包含有其他多種藥材，影響分離效果，筆者最終選擇甲醇-1%冰乙酸溶液(30∶70)為流動相。

[1] 王東風(fēng)，黃 娜. 薄層掃描法測定舒瘀丹中阿魏酸的含量[J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2012,21(18)：58-59.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2015年版第四部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：25.

[3] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(2015年版第一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：245.

[4] 陳燕飛，劉樂樂，王玉華，等. 薄層色譜法鑒定冬葵子中阿魏酸[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2008,30(2):115-117.

[5] 穆惠軍，關(guān)桂菊，高 琴. 心腦通膠囊中阿魏酸的定性鑒別與含量測定[J]. 山東中醫(yī)雜志，2002, 21(8):496-498.

[6] 秦 龍, 李 平,楊奇明,等.當(dāng)歸保肝膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2016,42 (2): 5-10.

[7] 顧秀琰,王雪梅,王 昕.當(dāng)歸、川芎不同配比中阿魏酸的含量測定[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2015,33(22):78-80.

(2016-06-20收稿 2016-08-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Qualitative identification and content determination of ferulic acid in Yansheng capsules

LI Hua and WANG Xiaohong. Pharmacy Department, Inner Mongolia Autonomous Region Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Force, Huhhot 010040, China

Objective To determine the content of ferulic acid in Yansheng capsules in order to provide reference for pharmaceutical production. Methods TLC was used to identify radix angelicae sinensis and rhizoma ligustici wallichii while high performance liquid chromatography(HPLC)was used for determination of ferulic acid. Chromatographic conditions for ferulic acid included a mobile phase composed of methanol and 1% ice acetic acid solution(30∶70), room temperature, and a detection wavelength of 320 nm. Results The result of TLC showed that the identification spots were clear and negative without any interference observed under a 365 mm UV-lamp using a silican gel layer and with ethane and ice acetic acid (16∶16∶2) as the solvent. Ferulic acid showed a good linearity and precision within the rangeof 0.2515-1.509 μg/μl,r=0.9995. The RSD of the constrast solution and the supplied test-solution was 0.35% and 0.73%, respectively. The average recovery was 99.22%, with an RSD of 1.4%. The supplied test-solution was basically stable within 6 hours. Conclusions This method is simple, accurate and reproducible, which can be used for quality control of Yansheng capsules.

thin layer chromatography; high performance liquid chromatography; Yansheng capsule; ferulic acid

李 華，本科學(xué)歷，主任藥師。

010041 呼和浩特，武警內(nèi)蒙古總隊(duì)醫(yī)院藥劑科

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