呂裕霞，李 卉，閆賦琴，冉 敏，李 嚴(yán)

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高壓氧對阿爾茨海默病模型小鼠認(rèn)知功能的影響

呂裕霞1，李 卉2，閆賦琴1，冉 敏3，李 嚴(yán)4

目的 探討應(yīng)用高壓氧對阿爾茨海默病模型小鼠認(rèn)知功能的影響及相關(guān)機(jī)制，為治療阿爾茨海默病提供參考。方法 將36只KM雄性小鼠隨機(jī)分成正常對照組、阿爾茨海默病模型組和造模后高壓氧處理組。用D-半乳糖(120 mg/kg)和亞硝酸鈉(90 mg/kg)制作阿爾茨海默病小鼠模型，利用Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行認(rèn)知功能檢測，并檢測小鼠海馬中的SOD、GSH-Px活性及 MDA含量。結(jié)果 與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長、跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P< 0.01)；與高壓氧處理前組相比，高壓氧處理后組小鼠的逃避潛伏期縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)增多，均存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠海馬中SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與高壓氧處理前相比，高壓氧處理后，阿爾茨海默病模型小鼠海馬SOD和GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 高壓氧治療可以改善阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與高壓氧治療可以顯著提高機(jī)體抗自由基損傷能力有關(guān)。

高壓氧； 阿爾茨海默病； 認(rèn)知功能； 氧化應(yīng)激

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種進(jìn)展性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，主要表現(xiàn)為失語、失用、失認(rèn)，以及人格和行為改變等[2]。該病起病緩慢或隱匿，多見于65歲以上老人[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年我國AD患者數(shù)為800萬，已成為繼心臟病、腫瘤、腦卒中后第四位引起成人死亡的原因[4]。隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展，老年人口占比越來越大，預(yù)計(jì)2040年我國阿爾茨海默病患者將達(dá)到2200萬，到時(shí)阿爾茨海默病必將成為一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，淀粉樣肽假說是AD發(fā)病機(jī)制的最主要的學(xué)說[6]。此外，越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激和自由基損害與AD發(fā)病極其密切[7]。因此，本研究擬通過在建立AD小鼠模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用高壓氧干預(yù)，探討高壓氧對AD小鼠的療效，并深入討論缺氧在AD發(fā)病機(jī)制中的作用，為AD的治療提供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 D-半乳糖(由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)：F20090420)；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase , GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)試劑盒(由南京建成生物工程有限公司提供)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高壓氧艙(煙臺(tái)宏遠(yuǎn)G2-Y900-002型)，Morris水迷宮系統(tǒng)、U-2800紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、9Thermo離心機(jī)、電子天平、恒溫水浴箱、低溫冰箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 日齡60～90 d雄性KM鼠36只，由本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量30～36 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為：正常對照組、阿爾茨海默病模型組和造模后高壓氧處理組，每組12只。

1.3 建立動(dòng)物模型 36只小鼠自由飲水，控制喂食量[4～5 g/(d·只)]，隨機(jī)分為3組，即正常對照組不給以任何藥物，正常飼養(yǎng)。阿爾茨海默病模型組和造模后高壓氧處理組共24只，參照羅煥敏方法[8]，按120 mg/kg D-半乳糖和90 mg/kg亞硝酸腹腔注射建立癡呆模型組，1次/d，持續(xù)注射60 d。造模40 d后，所有小鼠進(jìn)行水迷宮及跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，造模小鼠成績與正常對照組相比若有明顯差異，則判定為造模成功，最終24只小鼠全部造模成功。

1.4 高壓氧治療 把AD模型小鼠每日早上9：00放入動(dòng)物高壓氧實(shí)驗(yàn)艙，先用純氧逐漸加壓到0.18 MPa(1.8 ATA)，再慢慢減壓，用純氧洗艙3次后，再加壓到0.25 MPa(2.5 ATA)，吸氧60 min，經(jīng)20 min勻速減壓出艙；1次/d，10次為一個(gè)療程，中間間隔5 d，再進(jìn)行第2個(gè)療程[9]。

1.5 指標(biāo)的檢測

1.5.1 認(rèn)知功能測試 采用Morris水迷宮進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，檢測3組小鼠的認(rèn)知能力，記錄逃避潛伏期和120 s內(nèi)小鼠通過虛擬平臺(tái)的次數(shù)[10]。

1.5.2 檢測SOD、GSH-Px活性及MDA含量 所有行為學(xué)測試完成后，處死小鼠，取出小鼠腦組織，分離海馬組織，按照試劑盒說明書測定SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，各組之間的差異選用單因素方差分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮測試結(jié)果 與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長、跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與高壓氧處理前相比，高壓氧處理后，小鼠的逃避潛伏期縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)增多，均存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，表1)。

組別平均逃避潛伏期(s)穿越平臺(tái)次數(shù)正常對照組35.61±2.82②5.83±1.28②阿爾茨海默病模型組52.82±3.56①2.85±0.54①高壓氧處理組(前)50.71±3.28①2.72±0.62①高壓氧處理組(后)41.12±4.17②③5.57±1.41②

注： 與正常對照組比較，①P<0.01； 與高壓氧處理前比較，②P<0.01；與阿爾茨海默病模型組比較，③P<0.01

2.2 SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的檢測 如表2 所示，與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠海馬中SOD、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.01)；與處理前相比，高壓氧處理后，阿爾茨海默病模型組小鼠海馬SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

表2 各組小鼠SOD、GSH-Px活性和MDA含量變化比較 (n=12；

注：與正常對照組比較，①P<0.01； 與高壓氧處理前比較，②P<0.01；與阿爾茨海默病模型組比較, ③P<0.01

3 討 論

老年人由于機(jī)體組織再生性細(xì)胞減少和體內(nèi)自由基增加等原因造成機(jī)體各組織、器官發(fā)生退行性病變，醫(yī)學(xué)上把這一過程稱為衰老。AD是老年人群中的一種常見病和多發(fā)病。有資料表明，5%～15%的老年人有不同程度的阿爾茨海默病癥狀[11]。到目前為止，AD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但氧化應(yīng)激作為研究AD發(fā)病機(jī)制的一個(gè)靶點(diǎn)已成為研究的熱點(diǎn)[7]。由于AD發(fā)病因素涉及很多方面，單純的藥物治療很難取得很好的效果。由于AD患者腦血流量及耗氧量明顯低于正常同齡人，國外有研究證實(shí)，試用高壓氧吸入療法，取得了較好效果[12]。

本研究利用D-半乳糖(120 mg/kg)和亞硝酸鈉(90 mg/k)聯(lián)合制作AD小鼠模型。D-半乳糖可造成亞急性衰老模型，并會(huì)引起神經(jīng)元發(fā)生一系列退行性改變，包括神經(jīng)元數(shù)目減少，腦組織中SOD和GSH-Px活性下降，MDA水平升高，學(xué)習(xí)記憶能力下降等。隨后，筆者給阿爾茨海默病模型小鼠吸入0.25 MPa(2.5 ATA)高壓氧，1/d，每次60 min，10次為一個(gè)療程，中間間隔5 d，再進(jìn)行第2個(gè)療程，治療前后進(jìn)行認(rèn)知能力測驗(yàn)[9]。結(jié)果顯示，與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長、跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與高壓氧處理前相比，高壓氧處理后組小鼠的逃避潛伏期縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)增多，均存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。有文獻(xiàn)[13]報(bào)道，高壓氧可以提高腦組織內(nèi)含氧量，抑制由于乳酸堆積引起的細(xì)胞毒性及細(xì)胞部位的炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)腦組織內(nèi)自由基的清除，從而起到抑制腦細(xì)胞凋亡的作用。因此，用高壓氧治療，可使AD模型小鼠在適度的擴(kuò)血管同時(shí)，高倍地提高血氧濃度，增加血液與組織間氧分壓差，使外周血液中能量物質(zhì)充分氧化，提供足夠能量，腦組織含氧量大大提高，明顯改善腦細(xì)胞功能狀態(tài)，改善AD患者認(rèn)知能力[14]。

本研究顯示，對AD型小鼠采用高壓氧治療一段時(shí)間后，小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力能得到改善的同時(shí)，AD小鼠模型內(nèi)SOD和GSH-Px活性增高，以及MDA含量下降。AD的發(fā)生與腦組織中SOD和GSH-Px活性下降，MDA水平升高以及腦組織的持續(xù)缺氧相關(guān)，AD模型小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基加劇了腦組織脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生過量的MDA，使腦中MDA水平增加，細(xì)胞的合成能力降低，使SOD和GSH-Px活性顯著下降。這一結(jié)果提示高壓氧可以改善AD小鼠認(rèn)知功能，其作用機(jī)制很可能是影響腦組織中的SOD和GSH-Px活性及MDA的含量，從而起到抑制氧自由基的生成、保護(hù)腦細(xì)胞的作用。早期研究證實(shí)，SOD、GSH-Px和MDA是衡量機(jī)體抗氧化能力三種主要指標(biāo)[15]。SOD是參與自由基清除的重要酶，主要作用是參與催化產(chǎn)生超氧自由基，清除并阻斷自由基的產(chǎn)生[16]。GSH-Px清除氧自由基則是通過歧化作用，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[17]。MDA是氧自由基破壞細(xì)胞后的產(chǎn)物，它的存在可以使生物膜壞死，同時(shí)抑制SOD的活性，造成自由基的大量產(chǎn)生，從而加重了氧化應(yīng)激[18]。目前為止，腦組織SOD和GSH-Px活性和MDA含量影響AD模型小鼠認(rèn)知功能及相關(guān)發(fā)病機(jī)制還未完全闡明，很多研究認(rèn)為與腦內(nèi)乙酰膽堿脂酶活性降低有關(guān)，此外某些炎性反應(yīng)、缺血、缺氧等因素加速了AD模型小鼠的神經(jīng)元變性與死亡，使腦細(xì)胞及血管內(nèi)有異常淀粉樣蛋白沉淀，最終導(dǎo)致腦功能發(fā)生障礙。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，經(jīng)過高壓氧處理的AD模型小鼠認(rèn)知功能得到明顯改善，提高了AD模型小鼠海馬中SOD和GSH-Px活性，降低了海馬MDA水平，表明高壓氧可能通過清除AD模型鼠體內(nèi)自由基發(fā)揮改善認(rèn)知功能作用。但由于AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，AD動(dòng)物模型建立不一定能完全模擬AD患者發(fā)病的病理生理過程和臨床表現(xiàn)；此外，如何把握高壓氧的最佳治療時(shí)機(jī)、高壓氧劑量的選擇，以及需要配合的輔助治療等因素都值得考慮。因此，如何利用高壓氧治療臨床AD患者以及治療后的療效評價(jià)仍需進(jìn)一步研究。

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(2016-07-15收稿 2016-10-20修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Effects of hyperbaric oxygen on cognitive function in mice with Alzheimer’s

LV Yuxia1，LI Hui2,YAN Fuqin1,RAN Min3，and LI Yan4.1.Procurement Center Office，2.Department of Nutriology,3.Department of Neurology,4.Department of Hyperbaric Oxygenation,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039,China

Objective To investigate the effect of hyperbaric oxygen on cognitive functions of mice with Alzheimer’s and related mechanisms in order to contribute to the treatment of Alzheimer’s disease.Methods 36 KM mice were randomly divided into three groups: normal control group, dementia model group, and hyperbaric oxygen treatment group. D-galactose(120 mg/kg)and sodium nitrite (90 mg/kg)were used to establish a mouse model of Alzheimer’s. The cognitive functions of mice were determined by Morris water maze, the mice’s hippocampus SOD and GSH-Px activity. The MDA level was also determined.Results Compared with the normal control group, the escape latency of the dementia model mice were prolonged, but the times of spanning the platform were significantly reduced (P<0.01). After hyperbaric oxygen treatment, escape latency was shortened while the times of spanning the platform increased. The difference was of statistical significance (P<0.01). Compared with the control group, the hippocampus SOD and GSH-Px activity in dementia model group were significantly reduced, but the MDA level was significantly increased (P<0.01). Afterhyperbaric oxygen treatment, the hippocampus SOD and GSH-Px activity of dementia model mice were significantly increased while the MDA level was significantly reduced. There were significant differences (P<0.01).Conclusions Hyperbaric oxygen therapy can improve cognitive functions in mice with Alzheimer’s, which is possibly because hyperbaric oxygen can significantly improve the body’s ability to combat free radical damage.

hyperbaric oxygen; Alzheimer disease; cognitive function; oxidative stress

呂裕霞，碩士，主治醫(yī)師。

100039 北京，武警總醫(yī)院：1.采購中心，2.營養(yǎng)科，3.脊髓空洞科護(hù)士站，4.高壓氧治療科

李 嚴(yán)，E-mail:lvyuxia7118@163.com

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