張 卉 趙江海 索智敏

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 開封 475000)

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半乳糖凝集素1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞周期及遷移能力的影響及機制

張 卉 趙江海 索智敏

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 開封 475000)

目的 觀察半乳糖凝集素1(Galectin-1)表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞周期及遷移能力的影響及機制。方法 利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC9706細(xì)胞。細(xì)胞分為3組，即未處理組、對照siRNA組和Galectin-1 siRNA組。采用半定量RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各組食管鱗癌EC9706細(xì)胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)；運用流式細(xì)胞術(shù)分析Galectin-1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞周期的影響，采用Boyden小室分析Galectin-1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響。采用半定量RT-PCR和Western 印跡方法檢測Galectin-1表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞周期相關(guān)因子(cdk2、p27和p21)以及細(xì)胞遷移相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-14 mRNA和蛋白的表達(dá)水平的變化。結(jié)果 Galectin-1 siRNA組與未處理組和對照siRNA組相比，Galectin-1 siRNA組中Galectin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)；細(xì)胞周期在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)呈顯著升高(P<0.05)；細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯下降。Galectin-1 siRNA組中p27和p21 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著高于未處理組和對照siRNA組(均P<0.05)，而cdk2和MMP-14 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著低于未處理組和對照siRNA組(均P<0.05)。結(jié)論 Galectin-1 siRNA能有效下調(diào)食管鱗癌EC9706細(xì)胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)；Galectin-1表達(dá)下調(diào)能明顯抑制食管癌EC9706細(xì)胞周期靜止在G0/G1期，這可能與p21和p27表達(dá)的升高及cdk2表達(dá)的下調(diào)密切相關(guān)；并能降低食管鱗癌EC9706細(xì)胞的遷移，這可能與MMP-14表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。

食管鱗癌；Galectin-1；細(xì)胞周期；細(xì)胞遷移

食管鱗癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，治療主要采用外科手術(shù)聯(lián)合放、化療等輔助治療手段，但患者預(yù)后仍不樂觀。半乳糖凝集素(Galectins)是能與β-半乳糖苷結(jié)合的高度保守的一類蛋白家族。研究表明其參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞通訊、細(xì)胞存活、細(xì)胞生長以及趨化性〔1〕。本研究觀察Galectin-1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞周期及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞株 Galectin-1、β-actin兔抗人多克隆抗體、Galectin-1 siRNA、陰性對照siRNA購自Santa Cruz公司。脂質(zhì)體購自Invitrogen公司。食管鱗癌EC9706細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。其他常用劑由河南大學(xué)病理學(xué)實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞分組 未處理組：未轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞；對照siRNA組：用陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞；Galectin-1 siRNA組：利用Galectin-1 siRNA轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染 將EC9706細(xì)胞加入RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按試劑盒說明制備siRNA和脂質(zhì)體的混合物，并加入培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 半定量RT-PCR 用Trizol試劑進(jìn)行消化、裂解EC9706細(xì)胞。接著測光密度(OD)值定量RNA濃度，完成cDNA第一鏈的合成、目的基因的擴(kuò)增后利用Gene Tools軟件進(jìn)行灰度值分析。每個基因 mRNA的相對表達(dá)量=目的基因/內(nèi)參β-actin。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué) 將已消毒的20 mm蓋玻片置于3組不同細(xì)胞的90 mm培養(yǎng)皿中，按2×104ml的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片的制備，5 d后進(jìn)行免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色鑒定。Galectin-1一抗滴度1∶200。最后樹膠封片，利用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 細(xì)胞周期分析 取轉(zhuǎn)染后48 h的3組細(xì)胞，用0.2 %胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清；用PBS洗兩遍，離心后棄去，加入70 %冰乙醇固定30 min，4℃過夜；上機前，1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS漂洗3遍；加入1 ml PBS制成細(xì)胞懸液，加Rnase A(終濃度50 μg/ml)，室溫放置1 h；調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106，加1 ml碘化吡啶(100 μg/ml)，避光30 min，最后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.6 細(xì)胞遷移分析 利用Boyden小室分析3組細(xì)胞的遷移能力的變化。上下室之間用聚碳酸酯膜分開，膜上鋪人工基底膜Matrigel 120 μg/cm2，下室的微孔中加入已培養(yǎng)過的細(xì)胞的上清作為誘引劑，在上室的微孔中各加入細(xì)胞懸液25 μl (濃度為5×105個/ml)，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h；取出膜，輕輕擦去Matrigel matrix、尚未轉(zhuǎn)移至膜上的細(xì)胞，將膜用70%甲醇固定45 min，未結(jié)合型蘇木素染色5 min，流水沖洗終止；觀察遷移至膜上的細(xì)胞，每孔計數(shù)5個高倍鏡視野中的細(xì)胞數(shù)總和，求其平均值。穿膜細(xì)胞數(shù)目多少作為評價腫瘤細(xì)胞浸潤能力強弱的指標(biāo)。

1.2.7 Western印跡 按照全蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白，蛋白上清經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(4%濃縮膠，15%分離膠)后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉60 min。一抗(cdk2、p27、p21、 MMP-14)于4℃孵育過夜，TBST洗滌3次×10 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次×10 min，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育5 min，經(jīng)X線片曝光、顯影、定影。顯色結(jié)果用Gene Tools軟件進(jìn)行灰度分析，蛋白相對表達(dá)量=目的基因的表達(dá)量/內(nèi)參基因的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Galectin-1 siRNA對EC9706細(xì)胞中Galectin-1 mRNA表達(dá)的影響 Galectin-1 siRNA組中Galectin-1 mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而未處理組和對照siRNA組中Galectin-1 mRNA的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。見圖1。

2.2 免疫細(xì)胞檢測干擾前后Galectin-1蛋白表達(dá)的變化 利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測干擾前后3組細(xì)胞Galectin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，Galectin-1蛋白主要定位在胞質(zhì)中。在未處理組和對照siRNA組中，Galectin-1蛋白呈現(xiàn)強表達(dá)，而在Galectin-1 siRNA組中Galectin-1的表達(dá)水平極低。見圖2。

M：GeneRulerTM DNA Ladder Mix；1：未處理組；2：對照siRNA組；3：Galectin-1 siRNA組，下圖同圖1 Galectin-1 siRNA下調(diào)食管鱗癌EC9706細(xì)胞中Galectin-1 mRNA表達(dá)

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各組細(xì)胞中Galectin-1蛋白的表達(dá)(DAB，×200)

2.3 采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析Galectin-1表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞周期的調(diào)控 結(jié)果顯示，Galectin-1 siRNA組在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)比率(67.30±0.77)%明顯高于未處理組(55.31±1.01)%和對照siRNA組(55.03±1.62)%(F=104.195，P=0.000)。此外，Galectin-1 siRNA組在S期的細(xì)胞數(shù)比率(24.53±1.19)%顯著低于未處理組(31.35±1.17)%和對照siRNA組(31.85±0.84)%(F=43.186，P=0.000)，進(jìn)一步分析表明，Galectin-1 siRNA組在G2/M期的細(xì)胞數(shù)比率(8.18±0.57)%顯著低于未處理組(13.33±0.75)%和對照siRNA組(13.12±0.93)%(F=44.047，P=0.000)。而未處理和對照siRNA組在細(xì)胞周期的各個時相無差異(P>0.05)。

2.4 Boyden小室進(jìn)行檢測 Galectin-1表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞遷移能力的影響 Boyden小室結(jié)果顯示，未處理組和對照siRNA組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(156.71±5.59)及(149.35±6.10)，二者相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，然而與未處理組和對照siRNA組相比，Galectin-1 siRNA組中EC9706細(xì)胞的穿膜數(shù)(61.33±3.28)明顯下降(F=319.991，P=0.000)。見圖3。

2.5 Galectin-1表達(dá)下調(diào)對相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 圖4表明，Galectin-1 siRNA組中p27和p21 mRNA的表達(dá)顯著高于未處理組和對照siRNA組(均P<0.05)，而cdk2和MMP-14 mRNA的表達(dá)顯著低于未處理組和對照siRNA組(均P<0.05)。此外，未處理組和對照siRNA組之間上述各基因的表達(dá)無差異(P>0.05)。這些研究提示，Galectin-1表達(dá)下調(diào)所介導(dǎo)的細(xì)胞周期靜止和細(xì)胞遷移能力的降低與上述各基因mRNA表達(dá)的變化密切相關(guān)。

圖3 Galectin-1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌EC9706細(xì)胞遷移的影響(×200)

圖4 Galectin-1表達(dá)下調(diào)相關(guān)基因mRNA表達(dá)

2.6 Galectin-1表達(dá)下調(diào)對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Galectin-1 siRNA組中p27和p21蛋白的表達(dá)顯著高于未處理組和對照siRNA組(均P<0.05)，而cdk2和MMP-14蛋白的表達(dá)顯著低于未處理組和對照siRNA組(均P<0.05)，見圖5。此外，未處理組和對照siRNA組之間上述各蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，提示Galectin-1表達(dá)下調(diào)所介導(dǎo)的細(xì)胞周期靜止和細(xì)胞遷移能力的降低與上述各蛋白表達(dá)的變化密切相關(guān)。

圖5 Galectin-1表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

Galectins是能與β-半乳糖苷結(jié)合的高度保守的一類蛋白家族。這類蛋白家族分布廣，進(jìn)化上十分保守。當(dāng)前大多數(shù)研究認(rèn)為Galectins在細(xì)胞凋亡中的免疫調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答以及在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔2〕。已有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞與組織中Galectin-1呈現(xiàn)高表達(dá)〔3〕，然而Galectin-1在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)情況的國內(nèi)外研究報道較少。已有研究證實RNA干擾技術(shù)可以抑制腫瘤細(xì)胞中癌基因的過度表達(dá)，該技術(shù)將成為治療腫瘤的一種新的措施〔4～6〕。本研究結(jié)果顯示，Galectin-1 siRNA轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌EC9706細(xì)胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，同時也說明食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中存在Galectin-1 基因及蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步為后續(xù)研究Galectin-1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用提供理論依據(jù)。

Galectin-1在調(diào)控細(xì)胞的細(xì)胞周期的進(jìn)程中發(fā)揮極其重要的作用。Galectin1能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤和基質(zhì)骨髓細(xì)胞〔7〕。本研究表明Galectin-1 siRNA能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞周期靜止在G0/G1期，并阻礙DNA的合成的正常進(jìn)行。但是其相關(guān)的分子機制尚不清楚。有研究表明，Galectin1能誘導(dǎo)p21的轉(zhuǎn)錄和選擇性增加p27蛋白的穩(wěn)定性，而Galectin1介導(dǎo)的p27和p21的積累抑制細(xì)胞周期依賴性激酶2的活性，這將最終導(dǎo)致細(xì)胞周期靜止在G1期和生長的抑制〔8〕。為了探討Galectin-1表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的細(xì)胞周期靜止與cdk2、p27和p21的表達(dá)是否有關(guān)，本文結(jié)果提示Galectin-1表達(dá)的下調(diào)介導(dǎo)的細(xì)胞周期靜止與p27和p21蛋白的表達(dá)的升高和cdk2蛋白表達(dá)的降低密切相關(guān)。為了證實Galectin-1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌EC9706細(xì)胞遷移的影響，本文結(jié)果表明Galectin-1表達(dá)的下調(diào)能明顯抑制食管鱗癌EC9706細(xì)胞的遷移。MMP-14作為一種蛋白水解酶，可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，促使腫瘤細(xì)胞遷移。由于Galectin-1是乳腺癌中MMP-14的底物〔9，10〕，本文結(jié)果顯示下調(diào)Galectin-1表達(dá)所介導(dǎo)的EC9706細(xì)胞遷移能力降低可能與MMP-14表達(dá)的下調(diào)密切相關(guān)。

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〔2015-05-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

索智敏(1969-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事消化道腫瘤研究。

張 卉(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

R735.1

A

1005-9202(2016)22-5534-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.018