邢國(guó)杰，梅勝蘭，相鴻坤

上海柏慧康生物科技有限公司，上海 201203

引言

癌癥是當(dāng)今社會(huì)導(dǎo)致人類死亡的重要元兇之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，癌癥患者的主要死亡原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-3]。而循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell，CTC）則是癌癥轉(zhuǎn)移的直接原因[4-5]。1896年，研究人員就在一例因癌癥死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤的細(xì)胞，并首次提出CTC的概念[6-7]。當(dāng)人的循環(huán)系統(tǒng)中出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞即提示腫瘤存在轉(zhuǎn)移的可能性。對(duì)于CTC的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，癌細(xì)胞從循環(huán)介質(zhì)中分離之后的鑒定尤為重要[8]。目前，全世界范圍內(nèi)已經(jīng)研究出多種CTC的檢測(cè)方法，其中最常見(jiàn)的鑒定方法為美國(guó)強(qiáng)生公司開(kāi)發(fā)的熒光細(xì)胞染色鑒定方式[9-10]。而在國(guó)內(nèi)，目前尚無(wú)同類的國(guó)產(chǎn)CTC檢測(cè)產(chǎn)品通過(guò)食藥監(jiān)管理部門的注冊(cè)。為此，本項(xiàng)目組開(kāi)展了一款新型的自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)用于臨床CTC的檢測(cè)。

作為一款臨床檢驗(yàn)分析儀器，自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)的質(zhì)量控制必須符合原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局的相關(guān)法律法規(guī)要求。然而，市場(chǎng)上現(xiàn)有的質(zhì)控方式不具有普適性，僅適用于廠家自己的系統(tǒng)。為了解決自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)的質(zhì)控問(wèn)題，我們創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)了熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片。該樣片選取特制的帶有黑色方框的載玻片，用多聚賴氨酸進(jìn)行防脫處理[11]，分別制備空白對(duì)照、陽(yáng)性樣片A、陽(yáng)性樣片B三種規(guī)格，其中陽(yáng)性樣片上分別固定有特定數(shù)量的熒光染色腫瘤細(xì)胞。經(jīng)上海市計(jì)量測(cè)試研究院測(cè)試確認(rèn)后，我們將此標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片作為企業(yè)內(nèi)部的測(cè)試工具，用于對(duì)自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)成品的分析準(zhǔn)確性、分析精密度、分析復(fù)現(xiàn)性等性能指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)控。由于熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片可提供標(biāo)準(zhǔn)可控的熒光標(biāo)記物，除可以應(yīng)用于自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)的質(zhì)控外，該標(biāo)準(zhǔn)樣片還可以用于其他熒光成像及圖像分析類系統(tǒng)的熒光成像及目的細(xì)胞計(jì)數(shù)能力的評(píng)價(jià)，也可以作為此類系統(tǒng)的一種通用測(cè)試工具。

1 材料和方法

1.1 材料

定制載玻片（含10 mm×10 mm黑框）、多聚賴氨酸、超純水、棉簽、SK-BR-3細(xì)胞（乳腺癌細(xì)胞）、Anti-CK8/18-FITC熒光抗體、DAPI染色液、甘油、中性樹(shù)膠、蓋玻片。

1.2 方法

1.2.1 載玻片防脫處理

載玻片防脫處理過(guò)程為：① 取3 mL多聚賴氨酸，用2 mL超純水進(jìn)行稀釋，混勻后備用；② 取棉簽1根，蘸取稀釋好的多聚賴氨酸溶液，讓棉簽吸滿液體為止；③ 左手持定制載玻片，右手用棉簽順著一個(gè)方向均勻涂滿載玻片黑框區(qū)域；④ 將涂布好的載玻片依次放置于染色架中，至于陰涼通風(fēng)處，干燥后備用。

1.2.2 熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片的制備

（1）取消化好的SK-BR-3細(xì)胞，分別用Anti-CK8/18-FITC熒光抗體和DAPI染色液對(duì)其進(jìn)行染色，染色完成后對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，備用。

（2）取3片處理好的載玻片，分別標(biāo)記為空白對(duì)照、陽(yáng)性樣片A、陽(yáng)性樣片B。其中，向陽(yáng)性樣片A、陽(yáng)性樣片B的黑色方框內(nèi)分別滴加一定數(shù)量的熒光染色SK-BR-3細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量分別控制在50±5個(gè)、100±10個(gè)?？瞻讓?duì)照樣片不添加熒光染色SK-BR-3細(xì)胞。加好細(xì)胞的樣片放置暗室1 h使液體基本揮發(fā)完畢。

（3）向三塊載玻片的黑框中心區(qū)域分別滴加5 μL甘油，并沿著黑框滴加中性樹(shù)膠，最后蓋上蓋玻片，確保蓋玻片平整覆蓋在黑框區(qū)域上且無(wú)甘油溢出。用擦鏡紙擦去蓋玻片邊緣多余的中性樹(shù)膠后放置于暗室中室溫過(guò)夜晾干。

（4）用熒光顯微鏡對(duì)樣片中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，目的細(xì)胞識(shí)別條件為：明場(chǎng)可觀察完整細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)在熒光場(chǎng)下相同位置可分別觀察到綠色熒光和藍(lán)色熒光。重復(fù)計(jì)數(shù)3次后取平均值，陽(yáng)性樣片A、陽(yáng)性樣片B的細(xì)胞數(shù)平均值在50±5個(gè)、100±10個(gè)范圍內(nèi)則視為合格的熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片，熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片結(jié)構(gòu)示意圖，見(jiàn)圖1。

圖1 熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片的結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.3 自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)質(zhì)量控制檢測(cè)

1.2.3.1 分析準(zhǔn)確性

對(duì)陽(yáng)性樣片A、陽(yáng)性樣片B各測(cè)試10次，按照以下公式(1)和(2)計(jì)算測(cè)試平均值：

式中Xi為每次的測(cè)試值；n為測(cè)試次數(shù)。

按下列公式計(jì)算準(zhǔn)確性：

式中X0為標(biāo)準(zhǔn)值；X為測(cè)試平均值。

1.2.3.2 分析精密度

采用計(jì)算得到的平均值，按下列公式(3)和(4)計(jì)算變異系數(shù)：

式中X為測(cè)量平均值；Xi為第i次測(cè)試讀數(shù)；n為測(cè)量次數(shù)；SD為標(biāo)準(zhǔn)差；CV為變異系數(shù)；

1.2.3.3 分析復(fù)現(xiàn)性

每隔0.5 h為一個(gè)間隔，重復(fù)測(cè)試三次，計(jì)算平均值，一共測(cè)試4個(gè)間隔，取5個(gè)結(jié)果中的最大值（最小值），按下列公式(5)計(jì)算儀器復(fù)現(xiàn)性誤差：

式中S0為初始測(cè)試的讀數(shù)平均值；Si為測(cè)試結(jié)果平均值中的最大值（最小值）；i=1, 2, 3, 4, 5。

2 結(jié)果

2.1 分析準(zhǔn)確性

自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性樣片A和陽(yáng)性樣片B上熒光細(xì)胞數(shù)結(jié)果，見(jiàn)表1。

根據(jù)以上測(cè)試結(jié)果，計(jì)算得出陽(yáng)性樣片A和陽(yáng)性樣片B的細(xì)胞個(gè)數(shù)測(cè)試平均值分別為97和50。上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院對(duì)兩種陽(yáng)性樣片細(xì)胞個(gè)數(shù)的計(jì)量確認(rèn)值分別為96和49，以此為真值（以下相同），計(jì)算可得自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性樣片A和陽(yáng)性樣片B的測(cè)試準(zhǔn)確性分別為98.96%和97.96%。

2.2 分析精密度

根據(jù)表1的測(cè)試結(jié)果可計(jì)算出自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性樣片A和陽(yáng)性樣片B的測(cè)試SD值分別為1.67和1.00，所以計(jì)算得到CV值分別為1.72%和2.00%。

2.3 分析復(fù)現(xiàn)性

對(duì)陽(yáng)性樣片A、陽(yáng)性樣片B的復(fù)現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果，見(jiàn)表2和表3。由表2和表3的數(shù)據(jù)可計(jì)算出陽(yáng)性樣片A和陽(yáng)性樣片B復(fù)現(xiàn)性誤差分別為0.34%和1.33%。

表2 陽(yáng)性樣片A復(fù)現(xiàn)性檢測(cè)結(jié)果（細(xì)胞個(gè)數(shù)，個(gè)）

表3 陽(yáng)性樣片B復(fù)現(xiàn)性檢測(cè)結(jié)果（細(xì)胞個(gè)數(shù)，個(gè)）

3 討論

本研究制備了一種熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片，該樣片以定制的帶框載玻片為載體，經(jīng)過(guò)多聚賴氨酸防脫處理后，將一定數(shù)量的染色目的細(xì)胞封閉在方框區(qū)域內(nèi)。根據(jù)加入的細(xì)胞多少，分為空白片、陽(yáng)性A和陽(yáng)性B三種規(guī)格。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用制備的熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片對(duì)自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)的分析準(zhǔn)確性、分析精密度以及分析復(fù)現(xiàn)性進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果良好。

相比較常規(guī)的載玻片，本標(biāo)準(zhǔn)樣片使用了獨(dú)特的定制方框加防脫處理工藝。這種獨(dú)特的設(shè)計(jì)利用細(xì)胞中的陰離子和聚合物陽(yáng)離子之間的相互作用產(chǎn)生粘合力，從而保證載入的目的細(xì)胞可以被牢牢地吸附在玻片表面而不脫落[12]；同時(shí)將細(xì)胞限定在黑色方框區(qū)域內(nèi)，便于儀器快速對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行定位和識(shí)別。

由于我們的檢測(cè)系統(tǒng)是用于對(duì)CTC進(jìn)行計(jì)數(shù)，我們參考同類技術(shù)并選用上皮源的SK-BR-3細(xì)胞來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)樣片[13]，并對(duì)其進(jìn)行染色（細(xì)胞表面染綠色、細(xì)胞核染藍(lán)色）后制片。在對(duì)自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)時(shí)，熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片可與檢測(cè)系統(tǒng)單獨(dú)使用，無(wú)須配套檢測(cè)試劑。而強(qiáng)生公司的質(zhì)控方法是使用特定的熒光標(biāo)記細(xì)胞，其本身是一種封閉式系統(tǒng)，所以需要對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)的儀器及配套試劑進(jìn)行同時(shí)質(zhì)控[14-16]。相比較而言，我們的熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片具有使用簡(jiǎn)單、無(wú)須前處理直接用于測(cè)試、在有效期內(nèi)可重復(fù)使用、可直接儲(chǔ)存于常溫環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。

熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片為開(kāi)放式測(cè)試工具，如果根據(jù)測(cè)試需求對(duì)樣片上的目的細(xì)胞或者熒光染料進(jìn)行替換，可適用于其他類型細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)。因此，此方法可以作為一種通用手段，針對(duì)不同的預(yù)期用途設(shè)計(jì)不同的熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片。

由于熒光物質(zhì)無(wú)法避免淬滅問(wèn)題，這導(dǎo)致我們的熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片目前無(wú)法做到長(zhǎng)期儲(chǔ)存和使用。提高熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性將對(duì)延長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)樣片的有效期具有重要意義，未來(lái)需要著眼于此，力爭(zhēng)制備出有效期更長(zhǎng)的熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片。

4 結(jié)論

本研究制備了一種熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片，通過(guò)使用特制的載玻片為載體，經(jīng)過(guò)防脫處理后添加一定數(shù)量的熒光染色細(xì)胞，制得不同規(guī)格的熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片。利用該樣片對(duì)自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)的分析準(zhǔn)確性、精密度、復(fù)現(xiàn)性進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣片效果良好，可作為自動(dòng)熒光顯微分析系統(tǒng)的測(cè)試工具，用于該系統(tǒng)對(duì)上皮源循環(huán)腫瘤細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)功能的評(píng)價(jià)，成功地解決了該系統(tǒng)的質(zhì)控問(wèn)題。下一步，需要深入對(duì)熒光染料淬滅問(wèn)題進(jìn)行研究，做好熒光染色細(xì)胞的熒光防護(hù)，力求延長(zhǎng)熒光細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)樣片的有效期。