朱 騫，秦海斌，孫欽偉，宋珍華，張雅晨，溫 海，賀星亮，張匯東*

(1.公安部南京警犬研究所警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210012；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095)

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犬熱應(yīng)激過程中HSP70和免疫相關(guān)細(xì)胞因子的變化

朱 騫1，秦海斌1，孫欽偉2，宋珍華1，張雅晨2，溫 海1，賀星亮1，張匯東1*

(1.公安部南京警犬研究所警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210012；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095)

為研究熱應(yīng)激造成犬免疫機(jī)能損傷的機(jī)制及損傷過程中免疫相關(guān)細(xì)胞因子的變化規(guī)律，分別在夏季持續(xù)高熱天氣中每隔7d、分5次采集了拉布拉多犬的血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，檢測(cè)血清中皮質(zhì)醇(COR)、熱休克蛋白70(HSP70)、白細(xì)胞介素2((IL-2)和白細(xì)胞介素(IL-10)、Toll樣受體2(TLR-2)和Toll樣受體4(TLR-4)的含量及PBMC中HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4的mRNA的表達(dá)，并與春季非應(yīng)激溫度下檢測(cè)的同類指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，夏季持續(xù)高熱天氣中犬長期處于應(yīng)激狀態(tài)，其PBMC中HSP70mRNA表達(dá)上調(diào)，IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4mRNA表達(dá)下調(diào)；血清中COR濃度持續(xù)高于正常值，HSP70濃度升高，IL-2、TLR-2濃度未發(fā)生顯著變化，IL-10、TLR-4濃度顯著低于正常水平。熱應(yīng)激條件下PBMC中白介素和Toll樣受體mRNA表達(dá)下調(diào)，可能是導(dǎo)致犬的免疫功能抑制、抗感染免疫機(jī)能下降的原因。

犬；熱應(yīng)激；熱應(yīng)激蛋白；白細(xì)胞介素；Toll樣受體；mRNA

近年來，犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、伴侶動(dòng)物、軍警戰(zhàn)斗裝備在科學(xué)研究、社會(huì)生活、社會(huì)公共安全領(lǐng)域中發(fā)揮的作用日益增大，但由于冷熱、運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、免疫等引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)，經(jīng)常導(dǎo)致犬的免疫、內(nèi)分泌機(jī)能紊亂，甚至發(fā)生應(yīng)激性疾病乃至死亡[1-3]。熱應(yīng)激是最常見的應(yīng)激反應(yīng)，造成犬的生產(chǎn)和工作性能、抗病力的下降，但其發(fā)生機(jī)制，尤其是熱應(yīng)激對(duì)犬免疫機(jī)能的影響、免疫相關(guān)細(xì)胞因子的變化規(guī)律等均未見相關(guān)報(bào)道。本研究針對(duì)犬熱應(yīng)激期間血清和外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC))中的皮質(zhì)醇(cortisol，COR)、熱休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)、白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)和Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR-2)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR-4)等與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子和受體，研究它們?cè)诘鞍缀蚼RNA水平的變化，旨在揭示熱應(yīng)激對(duì)犬免疫機(jī)能的影響及細(xì)胞因子的調(diào)控規(guī)律，為犬的應(yīng)激理論、抗應(yīng)激藥物的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 試驗(yàn)用拉布拉多犬由公安部南京警犬研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，共12只，12月齡～18月齡，試驗(yàn)全程在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

1.1.2 主要儀器與試劑 放免設(shè)備PerkinElmer Wizard 1470自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)儀為珀金埃爾默儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；Step One Plus Realtime PCR System為ABI 公司產(chǎn)品；皮質(zhì)醇(COR)放射免疫分析藥盒為北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；犬HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2和TLR-4定量檢測(cè) ELISA試劑盒為上海朗頓生物科技公司產(chǎn)品；PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus) 為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；引物及探針由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 引物和探針 熒光定量PCR所用引物信息見表1。引物用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)犬分批及采樣方法 分批采樣方法參照文獻(xiàn)[4]，12只試驗(yàn)犬在春季非熱應(yīng)激溫度下采樣1次，作為正常對(duì)照組；進(jìn)入夏季高溫應(yīng)激期后，連續(xù)采樣4次，采樣間隔期為7d，分別作為第1、2、3、4批次熱應(yīng)激測(cè)量組(試驗(yàn)1組、2組、3組和4組)；同時(shí)記錄采樣當(dāng)日氣溫和濕度，計(jì)算溫濕指數(shù)(THI)以確定犬是否處于熱應(yīng)激狀態(tài)[5]。在安靜狀態(tài)下自犬的前肢內(nèi)側(cè)靜脈分別采集抗凝血、非抗凝血各2mL，抗凝血用于分離外周血單核細(xì)胞，非抗凝血用于分離血清，血清于-70℃保存，用于細(xì)胞因子ELISA定量。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 血清COR濃度測(cè)定 使用放射免疫法檢測(cè)5個(gè)批次血清樣本中COR的濃度，由南京市第一醫(yī)院臨床核醫(yī)學(xué)中心完成，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 血清中HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4蛋白定量 使用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4的含量。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 PBMC中HSP70、IL-2、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA表達(dá)量測(cè)定 Trizol法提取PBMC細(xì)胞總RNA，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，用熒光定量PCR檢測(cè)HSP70、IL-2、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA水平[6]。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 按照 SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 熒光定量試劑盒進(jìn)行，總體系為 20μL：cDNA 2μL，SYBR○RPremix ExTaqTM Ⅱ(2×)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各

0.5μL，ROX Reference Dye Ⅰ(150×)0.4μL，RNase-free水補(bǔ)齊 20μL。反應(yīng)條件：95℃ 2min；95℃ 5s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 20s。根據(jù)樣品相應(yīng)基因的Ct值，通過2-ΔΔCt法換算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 采樣當(dāng)日溫度、THI與血清中COR含量

采樣當(dāng)日的氣溫、THI及血清中COR的檢測(cè)結(jié)果見表2，可見采樣時(shí)氣溫均高于32℃，THI值高于80，此溫度、THI下試驗(yàn)犬均處于熱應(yīng)激狀態(tài)；血清中COR值也顯示，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組4次COR檢測(cè)值均顯著高于對(duì)照組，證明試驗(yàn)犬處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

表2 采樣當(dāng)日氣溫與THI值Table 2 Amnient temperatures and THI at the sampling days

2.2 血清HSP70含量和PBMC中HSP70mRNA表達(dá)量分析

不同批次血清樣品中HSP70含量檢測(cè)結(jié)果見表3?？梢?，與對(duì)照組相比，高溫條件下犬血清中HSP70濃度升高，其中第1批次樣品中HSP70含量極顯著升高(P<0.01)，第2批次下降，與對(duì)照組相比差異不顯著，第3、4批次的又略有升高，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

PBMC中HSP70的mRNA表達(dá)趨勢(shì)見表3。從表3可見，與對(duì)照組相比，高溫條件下4批次PBMC樣品中HSP70mRNA表達(dá)量第1批次顯著高于對(duì)照組，后面3個(gè)批次與對(duì)照組相比差異不顯著。

2.3 血清IL含量和PBMC中IL mRNA表達(dá)量變化

血清IL-2在4批次樣品中呈現(xiàn)先下降后升高趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，第1、2批次樣品中IL-2含量極顯著下降(P<0.01)，第3、4批次樣品中IL-2含量極顯著升高(P<0.01)。IL-10在4批次樣品中呈現(xiàn)先下降后升高趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，4批次樣品中IL-10含量均顯著降低(表4)。

PBMC中IL-2mRNA 表達(dá)呈先升高后下降趨勢(shì)，但總體均低于對(duì)照組的；第2批次PBMC中IL-2mRNA表達(dá)量最高。PBMC 中IL-10mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，前3批次PBMC中IL-10mRNA降低不顯著，但第4批次PBMC中IL-10顯著降低。

表3 HSP70血清中含量及PBMC中mRNA表達(dá)量變化Table 3 Changes of HSP70contents in serum and mRNA expressions in PBMC

表4 IL-2、IL-10在血清中含量及PBMC中mRNA表達(dá)量變化Table 4 Changes of IL-2and IL-10contents in serum and mRNA expressions in PBMC

2.4 血清TLR含量和PBMC中TLR mRNA表達(dá)量變化

結(jié)果見表5。血清TLR-2在4批次樣品中呈現(xiàn)波動(dòng)式變化，第1批次血清中TLR-2濃度升高但與對(duì)照組相比差異性不顯著，第2批次血清中TLR-2濃度迅速降低至低于對(duì)照組的且差異極顯著(P<0.01)，第3、4批次血清中TLR-2含量又逐步恢復(fù)至正常值且與對(duì)照組相比差異不顯著。血清TLR-4含量亦呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，4批次血清中TLR-4含量均低于對(duì)照組，第1、2批次的差異顯著，第3、4批次的差異極顯著(P<0.01)。

PBMC中TLR-2、TLR-4mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果見表5。 4批次PBMC中TLR-2mRNA表達(dá)呈先升高后降低，與對(duì)照組相比，前3批次樣品中的變化不顯著，第4批次樣品中TLR-2mRNA顯著降低(P<0.05)。TLR-4mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，前3批次的降低不明顯，第4批次樣品中TLR-4mRNA極顯著降低(P<0.01)。

表5 TLR-2、TLR-4在血清中含量及PBMC中mRNA表達(dá)量變化Table 5 Changes of TLR-2and TLR-4contents in serum and mRNA expressions in PBMC

3 討論

在人和其他動(dòng)物上進(jìn)行的應(yīng)激理論的研究已經(jīng)證實(shí)應(yīng)激能夠影響免疫機(jī)能[7-10]，這種影響是經(jīng)由神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間共有的化學(xué)信息分子(神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子等)及其受體來實(shí)現(xiàn)的[11-12]。細(xì)胞因子是一類具有調(diào)節(jié)免疫功能的小分子蛋白質(zhì)，它作為神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間信息交流的重要介質(zhì)，在應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要作用。目前，關(guān)于犬應(yīng)激過程中激素、熱應(yīng)激蛋白、細(xì)胞因子如何變化、如何相互影響并最終影響免疫機(jī)能改變的具體機(jī)制仍未闡明。外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞[13]，不僅能夠分泌多種細(xì)胞因子(HSP70、IL-2、IL-10、TLR-2、TLR-4等)，其細(xì)胞表面也具有多種重要的免疫相關(guān)抗原和受體，PBMC中相關(guān)因子的mRNA表達(dá)情況對(duì)于研究熱應(yīng)激與免疫抑制具有重要意義。

本研究對(duì)血清中COR、HSP70、IL2、IL-10、TLR-2和TLR-4的濃度變化以及PBMC中同類指標(biāo)的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析，來探討熱應(yīng)激過程中免疫機(jī)能損傷和調(diào)控的機(jī)制。

HSP70廣泛存在于細(xì)胞骨架和核骨架內(nèi)，與核仁和細(xì)胞膜結(jié)合提高細(xì)胞對(duì)熱的耐受力，高溫可誘導(dǎo)其在組織細(xì)胞內(nèi)快速高表達(dá)，以修復(fù)高溫引起的蛋白質(zhì)損傷，增強(qiáng)細(xì)胞抗御熱損傷的能力。外周循環(huán)血中也存在HSP70蛋白，其來源一方面是組織細(xì)胞死亡或凋亡時(shí)釋放，另一方面是應(yīng)激時(shí)組織細(xì)胞主動(dòng)分泌[14]，其含量變化與機(jī)體的病理、生理狀態(tài)密切相關(guān)。Pockley A G等[15]檢測(cè)人的循環(huán)血液中的HSP70，發(fā)現(xiàn)健康正常人在遭受心理和生理應(yīng)激時(shí)血漿HSP70也會(huì)升高，HSP70高表達(dá)可以有效保護(hù)應(yīng)激機(jī)體的心肌組織，若高溫應(yīng)激未能引起HSP70的高表達(dá)，則中暑發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性更大[16]。研究顯示，外周血中HSP70有可能參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，HSP70的刺激可導(dǎo)致單核細(xì)胞膜TLR-4受體數(shù)目顯著下調(diào)、TNF-α濃度增加[17]。本研究檢測(cè)了試驗(yàn)犬在中度熱應(yīng)激狀態(tài)下血液和PBMC中的熱應(yīng)激蛋白HSP70的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)無論是血清中還是PBMC中的HSP70均呈現(xiàn)先升高、后逐漸降低的趨勢(shì)，血清中蛋白含量和細(xì)胞中mRNA的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，說明在熱應(yīng)激初期HSP70的高表達(dá)對(duì)于維持組織細(xì)胞、包括PBMC的基本功能是必需的；對(duì)于PBMC而言，這種高表達(dá)是不連續(xù)的，在初期經(jīng)歷高水平表達(dá)后會(huì)回復(fù)至正常水平，但在熱應(yīng)激后期失去HSP70的保護(hù)會(huì)對(duì)PBMC的正常機(jī)能產(chǎn)生一定影響，本試驗(yàn)中測(cè)量的多個(gè)細(xì)胞因子和受體的下調(diào)可能與此有關(guān)。

白細(xì)胞介素是一類重要的細(xì)胞因子，其中IL-2是一種重要的Thl型細(xì)胞因子，具有免疫增強(qiáng)作用，多種免疫抑制疾病均與IL-2或IL-2受體表達(dá)紊亂有關(guān)；IL-10主要發(fā)揮抗炎及免疫抑制活性，它能抑制IL-2、IFN-γ及促炎因子的產(chǎn)生和釋放。本研究中，IL-10mRNA在PBMC中的表達(dá)在熱應(yīng)激初期保持正常水平，在后3批次PBMC中的表達(dá)持續(xù)下調(diào)；在血清中的含量則是在熱應(yīng)激初期下降至最低水平然后逐步恢復(fù)，但整個(gè)過程中均低于正常水平；IL-10在PBMC和血清中表達(dá)的同時(shí)下調(diào)，說明熱應(yīng)激對(duì)機(jī)體整體合成IL-10的具有明顯影響，并且提示熱應(yīng)激后期機(jī)體抗炎能力的會(huì)有一定減弱。對(duì)于PBMC中IL-2mRNA的持續(xù)下調(diào)，說明熱應(yīng)激影響了外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-2的合成；血清IL-2在后2批次血清樣品中的含量逐漸升高至正常水平，這可能是中樞免疫器官的代償性分泌，同時(shí)也可以看出熱應(yīng)激對(duì)IL-2的分泌影響不大。

TLRs是存在于細(xì)胞上介導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生的重要受體，在宿主防御反應(yīng)中的至關(guān)重要，是天然免疫與獲得性免疫的“橋梁”，關(guān)于TLRs的相關(guān)研究已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[18]。本研究中，血清TLR-2在4批次樣品中呈現(xiàn)波動(dòng)變化，第2批次顯著降低，第3批次又顯著升高；而PBMC中mRNA表達(dá)在第4批次顯著降低。血清TLR-4含量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，4批次血清中TLR-4含量均低于對(duì)照組，第1、2批次的差異顯著，第3、4批次的差異極顯著；PBMC中TLR-4mRNA的表達(dá)亦呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，且4批次樣品的測(cè)量值均低于正常值。這說明熱應(yīng)激造成了PBMC中TLR-2mRNA的表達(dá)下調(diào)，但可能由于TLR-2在脾臟和外周血白細(xì)胞中均有較高水平的表達(dá)，從而造成本研究中外周血白細(xì)胞中TLR-2的表達(dá)下調(diào)而并未造成血清中TLR-2的整體水平下降。而TLR-4在外周血白細(xì)胞的表達(dá)最為豐富，其表達(dá)情況受熱應(yīng)激的影響較為明顯，在本研究中則體現(xiàn)為TLR-4在血清中和PBMC中的協(xié)同下調(diào)。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激對(duì)犬的免疫機(jī)能產(chǎn)生了一定影響，外周血單核細(xì)胞主要細(xì)胞因子(IL-2、IL-10)、模式識(shí)別受體(TLR-2、TLR-4)表達(dá)量下調(diào)尤為明顯，鑒于PBMC及其表面標(biāo)志在先天免疫和獲得性免疫中的重要作用，其膜表面細(xì)胞因子和相關(guān)受體的下調(diào)必然會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能的減弱，筆者分析這可能是犬在經(jīng)歷長期熱應(yīng)激后免疫力低下、易受各種病原微生物侵害的的內(nèi)在原因。其次，血清中的IL-2、IL-10的整體水平能夠自我恢復(fù)，這有賴于機(jī)體的激素、熱應(yīng)激蛋白的調(diào)節(jié)和保護(hù)，但TLR-2、TLR-4含量的持續(xù)下調(diào)，也會(huì)對(duì)機(jī)體的抗感染免疫機(jī)能產(chǎn)生不利影響。

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Variation of HSP70and Some Related Cytokines during Heat Stress in Dogs

ZHU Qian1,QIN Hai-bin1,SUN Qin-wei2,SONG Zhen-hua1,ZHANG Ya-chen2,WEN Hai1,HE Xing-liang1,ZHANG Hui-dong1

(1.PolicedogTechnologyKeyLaboratoryofMPS,NanjingPolicedogResearchInstituteofMPS,Nanjing,Jiangsu,210012,China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210095,China)

To study the mechanism of the canine immune function damage under heat stress and changes of some related cytokines in this damage process，samples from twelve Labrado dogs were collected by five times at seven-day intervals in a continuous high temperature summer.Concentrations of COR,HSP70,IL-2,IL-10,TLR-2,TLR-4in sera and their mRNA expression levels in PBMC were detected by ELISA and real time RT-PCR.Each index under heat stress state was compared with the normal level under non heat stress in spring.Results of COR concentration showed that all dogs were under heat stress in the summer high temperatures.Concentrations of COR and HSP70increased in blood serum.IL-2and TLR-2unchanged,while IL-10and TLR-4levels decreased significantly.In PBMC,only the mRNA expression of HSP70was up-regulated.IL-2,IL-10,TLR-2,TLR-4mRNA were all down-regulated.These results proved that the increased expression of HSP70was neccessary for immune cells maintaining their normal structure and functions.Down-regulations of mRNA expressions of IL-2,IL-10,TLR-2and TLR-4in PBMC may be an important reason for immune suppression and anti-infection immune decline under chronic heat stress in dogs.

dog;heat stress;HSP70;interleukin;TLR;mRNA

2015-06-26

公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011ZDYJNJGQ011)；公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2010YYCXNJJQ151)

朱 騫(1980-)，女，江蘇揚(yáng)州人，碩士，主要從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.21

A

1007-5038(2016)01-0029-05