呂 偉，徐 珊，2，楊 政，范義增，李 磊，2，吳開杰，2，賀大林，2，郭 鵬，2

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061； 2．西安交通大學(xué)環(huán)境和疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

?

·基礎(chǔ)研究·

YAP調(diào)控腎癌細(xì)胞遷移的機(jī)制研究

呂 偉1，徐 珊1，2，楊 政1，范義增1，李 磊1，2，吳開杰1，2，賀大林1，2，郭 鵬1，2

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061； 2．西安交通大學(xué)環(huán)境和疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

目的 探究YAP對腎癌細(xì)胞遷移的影響及其調(diào)控機(jī)制。方法 查找TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行YAP表達(dá)與腎癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性分析；慢病毒感染建立YAP敲低穩(wěn)克隆細(xì)胞系，并通過Western blot和RT-PCR方法檢測YAP蛋白和 mRNA的表達(dá)；Transwell實(shí)驗(yàn)研究YAP敲低對腎癌細(xì)胞遷移的影響；鬼筆環(huán)肽免疫熒光染色法檢測YAP敲低對細(xì)胞偽足F-actin的影響。結(jié)果 分析TCGA數(shù)據(jù)庫資料得到，YAP mRNA表達(dá)量升高與腎癌T4期存在顯著相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 敲低YAP顯著降低腎癌細(xì)胞偽足的形成，從而影響細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論 YAP通過影響細(xì)胞F-actin形成以調(diào)控腎癌細(xì)胞的遷移能力。

YAP；腎癌細(xì)胞；F-actin；遷移能力

原發(fā)性腎細(xì)胞癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤男女性排名分別為第7及第9位，盡管包括靶向治療等新興治療方法的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性腎癌的5年生存率仍低于10%[1-3]。Hippo信號通路是目前研究較為清楚的有關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡作用的信號傳導(dǎo)通路，轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP(yes-associated protein)是Hippo通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子[4]。異常的YAP表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長并且引導(dǎo)體外細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化，并可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。SCHUTTE等[5]發(fā)現(xiàn)在腎癌細(xì)胞系通過敲低YAP的表達(dá)可以明顯抑制腎癌細(xì)胞的生長及遷移能力。F-actin是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，在腫瘤細(xì)胞中與腫瘤遷移密切相關(guān)。本研究旨在探討在腎癌細(xì)胞中敲低YAP后對F-actin的以及對細(xì)胞形態(tài)及遷移能力的影響，進(jìn)一步探究YAP調(diào)控腎癌細(xì)胞遷移能力的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 YAP敲低慢病毒載體由上海吉瑪公司構(gòu)建；人腎癌786-O細(xì)胞系購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，腎癌RCC42細(xì)胞系由美國德克薩斯大學(xué)達(dá)拉斯西南醫(yī)學(xué)中心Jer-Tsong Hsieh饋贈；RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自四季青公司；胰酶購自Sigma公司；兔抗人YAP多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；鬼筆環(huán)肽購自Sigma公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液購自Sigma公司；嘌呤霉素購自Sigma公司；Milicell小室，24-wells購自Millipore公司；普通細(xì)胞爬片購自西安潤德生物科技有限公司；IRDye 680RD 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、IRDye 800CW標(biāo)記的山羊抗兔二抗、Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)( LI-COR公司)；激光共聚焦顯微鏡購自Nikon公司。PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR?Primix Ex TaqTMII試劑盒購買于TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長，2～3 d換液，2.5 g/L胰酶傳代。每次換液或傳代均向所有培養(yǎng)皿中滴加2 μL/mL嘌呤霉素以篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1.2.2 慢病毒侵染腎癌細(xì)胞 接種細(xì)胞至24-well，密度為5 000/well，加入0.5 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。第2日移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入稀釋病毒液0.5 mL，同時(shí)建立正常對照組(normal control,NC)組。第3日移去細(xì)胞侵染后病毒液加入0.5 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。第4日收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot 病毒轉(zhuǎn)染786-O，RCC42細(xì)胞72 h后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞獲取總蛋白[6]，50 μg/孔上樣，12% SDS-PAGE電泳、110 V電壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加兔抗人YAP多克隆抗體和兔抗人GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，TBST漂洗5 min×6次，再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)，再次TBST漂洗后使用Oddessy近紅外掃描系統(tǒng)處理，目標(biāo)蛋白熒光強(qiáng)度值與對照組相比較，量化蛋白表達(dá)的相對表達(dá)水平，并以相對熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，以不同細(xì)胞系為橫坐標(biāo)作圖。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 病毒轉(zhuǎn)染786-O，RCC42細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，按照飛捷RNAfast200試劑說明書提取RNA，cDNA模板通過RNA反轉(zhuǎn)錄獲得，反轉(zhuǎn)錄體系參照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑說明書。YAP的mRNA表達(dá)檢測使用TaKaRa SYBR?Primix Ex TaqTMII反應(yīng)體系，上游引物序列為：TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA，下游引物序列為：TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT。采用GAPDH 作為內(nèi)參照物，上游引物序列為：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游引物序列為：GCCTTCTCCATGGTGGTGAA。mRNA表達(dá)水平采用△△Ct計(jì)算方法分析。

1.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 常規(guī)培養(yǎng)786-O NC、786-O YAP、RCC42 NC、RCC42 YAP 細(xì)胞，待細(xì)胞長滿至70%左右，胰酶消化、離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)并采用無血清培養(yǎng)基重懸至1.5×105個(gè)/mL，將Millicell放入24孔板，上室加入200 μL 細(xì)胞懸液，下室加入900 μL含100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出上室，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，PBS洗滌3次，1%結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽擦去微孔膜上層細(xì)胞。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)并做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 免疫熒光染色檢測細(xì)胞內(nèi)F-actin的表達(dá) 將滅菌后的細(xì)胞爬片(18 mm ×18 mm)置于6孔板內(nèi)，接種786-O NC、786-O YAP、RCC42 NC、RCC42 YAP 細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)使細(xì)胞長滿至60%左右后取出細(xì)胞爬片。用PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS洗3次，1 g/L Triton X-100 打孔5 min，BSA封閉30 min，5 μg/mL鬼筆環(huán)肽染色30 min，PBS洗3次，DAPI 核染色5 min，PBS洗3次，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，拍照并保存圖片。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析,t檢驗(yàn)對兩組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析(ANOVA) 進(jìn)行多組間差異比較，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 YAP mRNA表達(dá)水平與腎癌分期的相關(guān)性 癌癥基因組計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas, TCGA)[7]是目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，按照美國抗癌聯(lián)合會(American Joint Committee Cancer，AJCC)對腎癌T1～T4的分期[8]，探究YAP 的表達(dá)與腎癌分期間關(guān)系。通過查找TCGA數(shù)據(jù)庫，按照T1～T4分期分別找到268、69、178、11例患者數(shù)據(jù)，通過SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行YAP表達(dá)與腎癌分期相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在T4期YAP mRNA的表達(dá)明顯高于T1、T2、T3期(圖1)。

2.2 腎癌YAP KD穩(wěn)克隆細(xì)胞系建立及鑒定 慢病毒轉(zhuǎn)染786-O，RCC42細(xì)胞48 h后收集NC(negative control)，YAPKD(YAP knock down)組細(xì)胞，經(jīng)飛捷RNAfast200試劑提取細(xì)胞總mRNA并反轉(zhuǎn)錄后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，QT-PCR)檢測YAP mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后YAPKD組 YAP mRNA表達(dá)明顯少于NC 組(圖2A)。病毒轉(zhuǎn)染72 h收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞獲取總蛋白進(jìn)行Western blot法檢測。實(shí)驗(yàn)采用GAPDH為內(nèi)參，Western blot分析顯示，病毒轉(zhuǎn)染72 h后YAPKD組中YAP蛋白比NC組顯著下降，差異顯著(P<0.05)，且NC組同時(shí)可以檢測到Y(jié)AP蛋白的同分異構(gòu)體TAZ蛋白(圖2B)。證實(shí)786-O YAPKD與RCC42 YAPKD細(xì)胞系建立成功。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中在不分期下YAP mRNA的表達(dá)情況

2.3 YAP對細(xì)胞遷移能力的影響研究 將786-O NC、786-O YAP、RCC42 NC、RCC42 YAP 細(xì)胞計(jì)數(shù)并重懸至1.5×105個(gè)/mL，各加入200 μL 細(xì)胞懸液于上室，下室加入900 μL含100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出上室。經(jīng)清洗、固定、染色后輕擦去微孔膜上層細(xì)胞，放置于顯微鏡下，人工計(jì)數(shù)5 個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)穿過小室8 μm孔徑膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)平均數(shù)，786-O與RCC細(xì)胞系，NC組及YAPKD組分別為316、355個(gè)和114、117個(gè)(圖3),通過SPSS統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)YAP 敲低組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示下調(diào)細(xì)胞內(nèi)YAP 表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

圖2 YAPKD與NC組中YAP蛋白及mRNA表達(dá)量

A：Western blot示YAPKD組YAP蛋白表達(dá)明顯下降； B：qRT-PCR結(jié)果表明YAPKD組 mRNA表達(dá)明顯降低a、b、c、d：分別為786 O NC、786 O YAPKD、RCC42 NC、RCC42 YAPKD。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)研究YAP敲低對腎癌細(xì)胞遷移的影響

A：Transwell實(shí)驗(yàn)；B：786-O組穿過小室計(jì)數(shù)；C：RCC42組穿過小室計(jì)數(shù)。

2.4 YAP對細(xì)胞骨架F-actin的影響 F-actin作為細(xì)胞骨架對維持細(xì)胞的正常形態(tài)非常重要，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9-10]。為了觀察YAP對細(xì)胞F-actin表達(dá)影響，通過將細(xì)胞爬片(18 mm×18 mm)置于6孔板內(nèi)，接種786-O NC、786-O YAP、RCC42 NC、RCC42 YAP 細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)使細(xì)胞長滿至60%左右后取出細(xì)胞爬片，經(jīng)PBS清洗、4%多聚甲醛固定，以及F-actin鬼筆環(huán)肽染色及DAPI核染色激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。我們發(fā)現(xiàn)敲低YAP后，細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)發(fā)生一定改變，YAPKD組細(xì)胞形態(tài)變化顯著，呈現(xiàn)F-actin明顯減少，胞質(zhì)固縮，偽足減少，與周圍細(xì)胞連接不緊密等改變，而NC組無相應(yīng)改變，細(xì)胞形態(tài)正常(圖4)。結(jié)果證明YAP可以調(diào)控F-actin的表達(dá)。

圖4 鬼筆環(huán)肽染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察F-actin變化情況

3 討 論

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，向遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移是腎癌患者死亡的主要原因，由于腎癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不完全清楚，晚期腎癌的治療效果仍不理想，預(yù)后較差。YAP是Hippo-pathway通路關(guān)鍵蛋白，作為轉(zhuǎn)錄激活因子，通過其WW區(qū)域特異地與PXYY區(qū)域結(jié)合激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。其促進(jìn)腫瘤生長的作用已經(jīng)在包括胰腺癌[12-13]、肺癌[14]、乳腺癌[15]等實(shí)體腫瘤中得到證實(shí)。

本次實(shí)驗(yàn)通過在TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索，發(fā)現(xiàn)在T4期腎癌中YAP mRNA表達(dá)明顯高于其他分期，說明YAP的高表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展存在密切關(guān)系。CAO等[16]通過對腎癌患者組織切片染色發(fā)現(xiàn)YAP蛋白在已發(fā)生轉(zhuǎn)移、分化差的組織中高表達(dá)。這與數(shù)據(jù)庫中結(jié)果相符合，為進(jìn)一步研究YAP與腎癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移提供了線索。本次實(shí)驗(yàn)通過慢病毒載體成功建立RCC42以及786-O YAPKD細(xì)胞系。Western blot、QT-PCR檢測蛋白及mRNA表達(dá)確定細(xì)胞系建立成功。分析Western blot時(shí)，我們在NC組內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了YAP蛋白的同分異構(gòu)體TAZ蛋白。TAZ在多種腫瘤中也被證實(shí)為促癌基因[17]。通過細(xì)胞爬片，經(jīng)鬼筆環(huán)肽F-actin染色及DAPI核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)在YAPKD組F-actin明顯減少。據(jù)此推測F-actin可能是YAP通路的下游目的蛋白之一。F-actin是細(xì)胞骨架中重要結(jié)構(gòu)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)有，學(xué)者認(rèn)為可以通過F-actin的表達(dá)水平來預(yù)測細(xì)胞遷移能力[18-19]。 我們在實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)YAPKD組細(xì)胞穿過小室細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組，據(jù)此我們推測YAP蛋白通過調(diào)低F-actin的表達(dá)降低細(xì)胞遷移能力。這與SCHUTTE等[5]的研究結(jié)果相同，同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)YAP的低表達(dá)細(xì)胞系表現(xiàn)更強(qiáng)的侵襲能力，但是具體機(jī)制尚未闡明。DAI 等[20]發(fā)現(xiàn)Lats1/2的磷酸化可以在激活YAP向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的同時(shí)導(dǎo)致AMOT磷酸化從而抑制F-actin聚合。REGUE等[21]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通過GPCRs信號通路激活的F-action聚合可以促進(jìn)Lats1/2的磷酸化導(dǎo)致YAP向核內(nèi)轉(zhuǎn)移激活下游基因轉(zhuǎn)錄，REDDY等[22]發(fā)現(xiàn)actin細(xì)胞骨架是Hippo通路上游的一種調(diào)節(jié)因子，能夠激活YAP并且增強(qiáng)其下游CCN生長因子的表達(dá)。可見Hippo通路激活下YAP與F-actin亦可獨(dú)立參與腫瘤遷移的過程。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測YAP與F-actin之間可能存在一個(gè)環(huán)狀信號通路，相互促進(jìn)調(diào)節(jié)共同調(diào)控腎癌細(xì)胞的遷移能力。

本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)YAP通過調(diào)節(jié)F-actin的表達(dá)來調(diào)控腎癌細(xì)胞遷移能力，為進(jìn)一步靶點(diǎn)于YAP的腎癌治療提供了理論基礎(chǔ)。

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(編輯 何宏靈)

Effect of YAP expression on the mirgation of renal cancer cells and its mechanism

Lü Wei1, XU Shan1,2, YANG Zheng1, FAN Yi-zeng1, LI Lei1,2, WU Kai-jie1,2, HE Da-lin1,2,GUO-Peng1,2

(1. Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 2. Key Laboratory of Environment and Disease-Related Genes of the Chinese Ministry of Education, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the effect of YAP on the migration of renal cancer cells and its mechanism. Methods The correlation between expression of YAP and T stages of renal cell carcinoma was detected in TCGA database. Stable YAP low expression cell lines were constructed with Lentivirus vector. The YAP protein and mRNA expressions were detected with Western blot and quantitative real-time PCR (QT-PCR). The effect of YAP low expression on the migration ability of renal cancer cells was detected with Transwell assay. The effect of YAP low expression on F-actin was detected with Rhodamine phalloidin staining.Results The high expression of YAP was significantly correlated with T4 stages of renal cell carcinoma (P<0.05). Knocking down of the YAP decreases the formation of F-actin, leading to lower migration ability of renal cell carcinoma cells. Conclusion YAP affects the migration ability of renal cancer cells by affecting the formation of F-actin.

Yes-associated protein; renal cancer cells; F-actin; migration

2016-01-21

2016-07-27

國家自然科學(xué)基金(No.81602244;No.81372279)

賀大林，教授.E-mail:hedl@mail.xjtu.edu.cn 郭鵬，教授.E-mail:guopeng661@mail.xjtu.edu.cn.系共同通訊作者

呂偉(1991-)，男(漢族)，在讀碩士研究生;研究方向：泌尿系腫瘤. E-mail:llvwei@qq.com 徐珊(1984-)，女(漢族)，碩士學(xué)位，助理研究員;研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail:shanhuxs@163.com.系共同第一作者

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10.3969/j.issn.1009-8291.2016.11.014