向 彬,種 鐵，雷光輝，張 旭，趙鵬靚，崔 杰

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；2.西電集團(tuán)醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710077；3.安康市中心醫(yī)院腫瘤科，陜西安康 725000)

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·臨床研究·

SMG-1在腎細(xì)胞癌中表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的意義

向 彬1,2,種 鐵1，雷光輝2，張 旭2，趙鵬靚2，崔 杰3

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004；2.西電集團(tuán)醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710077；3.安康市中心醫(yī)院腫瘤科，陜西安康 725000)

目的 檢測(cè)生殖器形成抑制基因-1(SMG -1)在腎癌組織中的表達(dá)情況，研究SMG -1的表達(dá)與腎癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)SMG -1在58例腎癌組織及32例癌旁組織的表達(dá)情況。用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用χ2檢驗(yàn)SMG -1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，Kaplan-Meier法及Cox回歸模型用于腎癌的生存分析。結(jié)果 SMG -1在腎癌組織陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁組織(20/58vs. 23/32,P=0.001)。按照TNM分期及Fuhrman分級(jí)，在Ⅰ+Ⅱ期腎癌患者中SMG -1表達(dá)高于在Ⅲ+Ⅳ期(17/39vs. 3/19,P=0.036)，在G1+G2腎癌患者中SMG -1表達(dá)高于G3+G4患者(18/41vs. 2/17,P=0.01)。SMG -1高表達(dá)的患者總生存期長(zhǎng)于SMG -1低表達(dá)的患者(P=0.018)。SMG -1高表達(dá)是腎癌預(yù)后良好的獨(dú)立因素[風(fēng)險(xiǎn)比(HR)=0.289, 95%CI=0.126～0.662,P=0.003]。結(jié)論 SMG -1異常表達(dá)可能參與腎癌的發(fā)生和進(jìn)展。SMG -1的高表達(dá)可作為預(yù)測(cè)腎癌良好預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

腎癌；SMG-1；預(yù)后；免疫組織化學(xué)

腎癌是成人常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，期中腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)最為常見(jiàn)，約占90%～95%[1]。腎癌尤其是透明細(xì)胞癌臨床表現(xiàn)及腎外表現(xiàn)不典型，很難做到早期診斷和早期治療，即使行手術(shù)治療后也將近有30%的患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]；轉(zhuǎn)移性腎癌的預(yù)后極差，平均生存時(shí)間僅僅月3個(gè)月左右，3年存活率低于5%[3]。目前臨床上迫切需要研究出新的有診斷或預(yù)后價(jià)值的分子標(biāo)志物，這對(duì)進(jìn)一步研究分析腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及預(yù)后監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。近期研究逐漸揭示生殖器形成抑制基因-1(suppressor of morphogenesis in genitalia-1，SMG-1)是長(zhǎng)期以來(lái)被忽略的重要抑癌基因，SMG-1的失活和表達(dá)缺失可能在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[4-5]。本研究旨在研究SMG-1在腎細(xì)胞癌中表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本研究共收集腎癌組織標(biāo)本共58例，病理類型均為腎透明細(xì)胞癌，于2005～2013年在西電集團(tuán)醫(yī)院泌尿外科行根治性腎切除術(shù)中取得。排除多發(fā)腫瘤，術(shù)前行放療、化療及免疫治療及術(shù)后隨訪資料不完整的患者。腎癌術(shù)后病理診斷由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科醫(yī)生確認(rèn)。使用2010年美國(guó)癌癥委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)的TNM分期系統(tǒng)對(duì)腫瘤分期，使用Fuhrman系統(tǒng)對(duì)腫瘤分級(jí)。病理特征見(jiàn)表1?；颊吣挲g34～78歲，中位年齡54.5歲：≥55歲者30例，<55歲者28例；男性35例，女性23例。配對(duì)癌旁腎癌組織為32例，癌旁組織均取自距離腫瘤邊緣2 cm 處的腎組織。原發(fā)腎癌分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期19例；按照Fuhrman分級(jí)G1+G2 患者41例，G3+G4 患者17例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移4例。所有患者的手術(shù)標(biāo)本，包括腎癌組織和癌旁組織，均經(jīng) 10%甲醛溶液固定，石蠟包埋4 μm連續(xù)切片，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器 鼠抗人酶SMG-1抗體(稀釋濃度1︰100)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，通用型SABC檢測(cè)試劑盒及濃縮型DAB檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)SMG-1在腎癌及癌旁組織中的表達(dá)。各步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書操作。石蠟切片置于65℃烤箱中1 h，在二甲苯乙醇梯度脫蠟水化后，采用高壓鍋法進(jìn)行抗原修復(fù)，加入3% H2O2反應(yīng)，生物素阻斷劑阻斷；分別加人一抗鼠抗人抗體SMG-1，工作稀釋比例為1︰100，4℃過(guò)夜孵育，再加入二抗于37℃孵育30 min，DAB顯色，脫水，透明，固定。PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 染色結(jié)果判定 采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片，染色評(píng)判方法為根據(jù)組織細(xì)胞的染色強(qiáng)度結(jié)合染色比例綜合判斷。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400倍)，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，觀察陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并進(jìn)行綜合評(píng)分：陽(yáng)性染色比例為0～39%為0分；陽(yáng)性染色比例為40%～69%為1分；陽(yáng)性染色比例≥70%為2分。根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)算分?jǐn)?shù)：無(wú)染色顆粒為0分，著色為黃色顆粒為1分，著色為棕黃色顆粒為2分。最終結(jié)果取兩者評(píng)分之和，0～1分為低表達(dá)，2～4分為高表達(dá)。

1.5 隨訪 對(duì)所有腎癌患者術(shù)后門診或電話隨訪?？偵嫫?overall survival，OS)為手術(shù)之日算起，終止日期為死亡或末次隨訪日期，隨訪截止日期為2015年10月11日。隨訪時(shí)限為40～92月，中位隨訪時(shí)間為78月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SMG-1蛋白的表達(dá)與腎癌臨床病理因素的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲線用Log-rank檢驗(yàn)，Cox多因素回歸模型分析各變量與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系。所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SMG-1在腎癌組織及癌旁組織的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SMG-1在腎癌及癌旁組織均有表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜，細(xì)胞核有少量表達(dá)。其他位置未見(jiàn)明顯著色(圖1)。如表1所示，腎癌組織SMG-1蛋白高表達(dá)率為34.48%，癌旁組織中SMG-1高表達(dá)率為71.88%。SMG-1在腎癌組織表達(dá)低于在癌旁組織中表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)SMG-1在腎癌及癌旁組織的表達(dá)(×400)

A:陰性對(duì)照；B腎癌組織低表達(dá)；C:腎癌組織中高表達(dá)；D:癌旁組織中高表達(dá)

2.2 SMG-1蛋白表達(dá)與腎癌病理特征之間的關(guān)系 SMG-1蛋白表達(dá)與腎癌患者年齡、性別、轉(zhuǎn)移不相關(guān)，但與腎癌分期和Fuhrman分級(jí)有關(guān)。在臨床分期為Ⅰ、Ⅱ患者中SMG-1高表達(dá)率顯著高于Ⅲ、Ⅳ患者(P=0.036)。通過(guò)Fuhrman分級(jí)，在G1和G2腎癌患者中SMG-1高表達(dá)率顯著高于在G3和G4期患者中表達(dá)(P=0.010)。見(jiàn)表2。

表1 SMG-1蛋白在腎癌組織和癌旁組織的表達(dá) [例(%)]

表2 SMG-1表達(dá)與腎癌組織臨床病理特征關(guān)系 [例(%)]

2.3 腎癌組織SMG-1蛋白表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系 腎透明細(xì)胞癌術(shù)后SMG-1蛋白高表達(dá)組的中位OS顯著高于低表達(dá)組，兩者之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.018，表3)。SMG-1不同表達(dá)的腎癌患者總生存曲線如圖2所示。

圖2 SMG-1的表達(dá)與腎癌患者總生存期的生存曲線

表3 SMG-1不同表達(dá)水平腎癌患者中位總生存期比較

組 別例數(shù)中位OS(月)95%CIχ2值P值SMG-1高表達(dá)組2081(75.73～87.59)5.560.018SMG-1低表達(dá)組3868(62.70～71.95)

2.4 影響腎癌患者預(yù)后的因素 對(duì)58例腎癌患者生存資料進(jìn)行預(yù)后分析，采用Cox多因素回歸分析模型，應(yīng)變量是的患者的總生存時(shí)間(OS)，協(xié)變量為性別(男vs.女)，年齡(≥55歲vs.<55歲)，SMG-1(分高表達(dá)、低表達(dá)兩組)，腫瘤分期(Ⅰ+Ⅱvs.Ⅲ+Ⅳ)，F(xiàn)uhrman分級(jí)(G1+G2vs.G3+G4)，采用向前逐步法篩選協(xié)變量，檢驗(yàn)引入?yún)f(xié)變量的標(biāo)準(zhǔn)是：年齡、性別、SMG-1表達(dá)、腫瘤分期、分級(jí)。多因素回歸模型顯示腎癌分期、Fuhrman分級(jí)及SGM-1與腎癌預(yù)后有關(guān)。較早的腫瘤分期及分級(jí)，高表達(dá)SMG-1的患者預(yù)示著較好的預(yù)后。見(jiàn)表4。

表4 腎癌預(yù)后多因素分析

變 量風(fēng)險(xiǎn)比(HR)95%CIP值性別:女vs.男1.032(0.897～1.187)0.659年齡(歲):≥55vs.<550.796(0.393～1.611)0.526分期:Ⅰ+Ⅱvs.Ⅲ+Ⅳ0.216(0.103～0.452)0.001分級(jí):G1+G2vs.G3+G40.436(0.203～0.936)0.036SMG-1:高vs.低0.289(0.126～0.662)0.003

3 討 論

SMG-1是最近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，已經(jīng)明確的是SMG-1可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡等多個(gè)生物進(jìn)程。但是文獻(xiàn)報(bào)道SMG-1在不同腫瘤組織中的表達(dá)對(duì)其預(yù)后有著不同作用。GUBANOVA等[6]在人類乳頭瘤病毒陽(yáng)性的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)，SMG-1因其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化而導(dǎo)致其表達(dá)降低，提高了這些患者的生存期，該研究結(jié)果提示SMG-1發(fā)揮著“癌”基因的功能。而GUBANOVA等[7]也報(bào)道SMG-1通過(guò)調(diào)節(jié)P53和CDc25A信號(hào)通路抑制腫瘤的生長(zhǎng)。最近報(bào)道SMG-1在肝癌組織及急性髓性白血病中發(fā)揮著抑癌基因的作用，低表達(dá)SMG-1預(yù)示著肝癌患者的不良預(yù)后。而周學(xué)軍等[8]報(bào)道了，雖然在喉鱗癌組織中SMG-1表達(dá)低于癌旁組織，但SMG-1蛋白表達(dá)陰性組5年生存率卻明顯高于陽(yáng)性組。這表明SMG-1在腫瘤預(yù)后中的作用具有多元性及復(fù)雜性，對(duì)此需要更加深入的研究。

本研究中，用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了SMG-1在腎癌組織及匹配癌旁組織中的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)在腎癌組織中SMG-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于其在癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率。進(jìn)一步分析SMG-1的表達(dá)與腎癌病理特征的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)SMG-1的表達(dá)與分期和Fuhrman分級(jí)有關(guān)，較早分期和分級(jí)的腎癌患者中SMG-1的表達(dá)率更高。分析對(duì)患者的總生存期，發(fā)現(xiàn)SMG-1高表達(dá)的患者總生存期長(zhǎng)于其低表達(dá)的患者。Cox多因素生存分析顯示腫瘤分期、Fuhrman分級(jí)、SMG-1表達(dá)水平是影響腎癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，說(shuō)明SMG-1的表達(dá)可作為檢測(cè)腎癌預(yù)后的指標(biāo)。

需要指出的是本研究仍有一些不足。本研究屬于回顧性研究，納入腎癌的病例數(shù)相對(duì)偏少會(huì)導(dǎo)致患者代表性較差，可能會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)一定偏倚。另外，雖然免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)蛋白在組織標(biāo)本上的表達(dá)是一種經(jīng)典的方法，但仍是一種半定量的評(píng)判手段，在操作過(guò)程中抗體的質(zhì)量和濃度以及最后對(duì)染色結(jié)果的評(píng)判都會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生影響。因此在應(yīng)用上述結(jié)果時(shí)需考慮到這些不足。當(dāng)然SMG-1真正作為一種有效的預(yù)后指標(biāo)還需多中心更大的樣本驗(yàn)證，并進(jìn)一步研究SMG-1在腎癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制。另外，考慮到腫瘤組織標(biāo)本取材的不便，在實(shí)際臨床應(yīng)用中，腎癌組織中檢測(cè)SMG-1蛋白的表達(dá)作為腎癌的預(yù)后標(biāo)志物存在一定的局限性。因此我們?cè)诤笃趯?shí)驗(yàn)中，會(huì)同期收集腎癌患者血液樣本，進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)檢測(cè)，同時(shí)標(biāo)記SMG-1，深入研究其作為腎癌指標(biāo)的應(yīng)用價(jià)值。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SMG-1在腎癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與腎癌臨床分期、Fuhrman分級(jí)有關(guān)，高表達(dá)SMG-1的患者預(yù)后較好，SMG-1可能成為監(jiān)測(cè)腎癌尤其是腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的理想指標(biāo)。

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(編輯 何宏靈)

The expression and prognostic significance of SMG-1 in renal cell carcinoma

XIANG Bin1,2,CHONG Tie1,LEI Guang-hui2,ZHANG Xu2,ZHAO Peng-jing2,CUI Jie3

(1.Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2.Department of Urology, Xidian Group Hospital, Xi’an 710077；3.Department of Oncology Ankang Central Hospital,Ankang 725000 China)

Objective To investigate the expression of suppressor of morphogenesis in genitalia-1 (SMG-1) and to evaluate the association between SMG-1 expression and clinicopathological characteristics and prognosis of renal cell carcinoma (RCC). Methods The expression of SMG-1 was detected by immunohistochemistry in 58 RCC cases and 32 paired adjacent non-cancerous tissues. SPSS18.0 package was used for statistical analysis. The association between SMG-1 expression and clinicopathological characteristics of RCC was evaluated byχ2test.Kaplan-Meierplots and Cox’s proportional hazards regression model were used to analyze the survival data of RCC. Results The expression of SMG-1 in RCC was significantly lower than that in paired adjacent non-cancerous tissues (P<0.05). According to TNM stage and Fuhrman grading system, the expression of SMG-1 in RCC cases with the stage Ⅰ+Ⅱ or G1+G2 was higher than that in patients with Ⅲ+Ⅳ(17/39vs.3/19;P=0.036) or grade G3+G4. (18/41vs.2/17;P=0.01).The patients with high expression of SMG-1 had a better overall survival than patients with low expression of SMG-1 (P=0.018). High expression of SMG-1 was an independent predictive factor for favorable prognosis of RCC patients (HR=0.289, 95%CI=0.126-0.662,P=0.003). Conclusions Aberrant expression of SMG-1 may be involved in RCC progression. Increased SMG-1 expression can be used as a favorable prognostic factor for RCC.

renal cell carcinoma; SMG-1; prognosis; immunohistochemistry

2016-06-06

2016-10-12

崔杰，主治醫(yī)師.E-mail：akcuijie@163.com

向彬(1979-)，男(漢族)，學(xué)士學(xué)位，主治醫(yī)師，主要從事泌尿系腫瘤發(fā)病機(jī)制研究和臨床診療工作.E-mail：13772466732@139.com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.11.009