安先霞林學(xué)仕

(1.永靖縣川城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,甘肅永靖 731600; 2.永靖縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅永靖 731600)

實(shí)驗(yàn)室檢測奶牛結(jié)核病的方法比較

安先霞1林學(xué)仕2

(1.永靖縣川城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,甘肅永靖 731600; 2.永靖縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅永靖 731600)

奶牛結(jié)核病屬于人畜共患傳染病，該病嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全，是由牛結(jié)核分枝桿菌引起，奶牛是家畜中最易感染該病的動(dòng)物。多年來，奶牛結(jié)核病已成為制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和危害人類健康的重要因素。為了更好地防控奶牛結(jié)核病，用兩種方法檢測結(jié)核?。号Ｐ吞峒兘Y(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素檢測技術(shù)檢測比較，分析其優(yōu)劣，為以后的檢測工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑盒

瑞士Prionics公司Bovigam牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測試劑盒，購買于北京測迪科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

牛結(jié)核菌素由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，Bovigam牛型提純結(jié)核菌素（BoPPD）和Bovigam禽型提純結(jié)核菌素（AvPPD）購買于北京測迪科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)牛群

選擇全縣飼養(yǎng)的531頭奶牛，從2014年開始到2016年，每年3～4月份和9～10月份，進(jìn)行結(jié)核病檢測。

1.2 方法

1.2.1 牛型提純結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T18645-2002）》，在奶牛頸部用牛型PPD進(jìn)行皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，劑量為2000IU/頭，分別在注射前和注射后72h測量皮膚厚度，并計(jì)算出皮厚差，對于皮厚差在2.0mm以上的（包括2.0mm）疑似陽性牛再進(jìn)行對側(cè)重復(fù)檢查，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.2.2 牛結(jié)核γ-干擾素檢測試驗(yàn)

皮內(nèi)試驗(yàn)第3d采集單側(cè)陽性牛的血液（每頭6ml），放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒3～5次，使肝素和血液充分混勻，放入22℃恒溫箱中，運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，并在采血后第20h進(jìn)行培養(yǎng)。輕輕顛倒試管10次，在無菌條件下，用一次性自動(dòng)移液器將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭奶牛加3孔1.5ml血樣。每個(gè)血樣3個(gè)孔分別加入100μlPBS、禽型提純結(jié)核菌素、牛型結(jié)核菌素將含有血液和抗原的組織培養(yǎng)板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育21.5h。孵育后將24孔板在室溫下（25℃），500rmin，離心lOmin，小心吸取上層血漿，放入1.5ml的離心管中。然后按照試劑盒說明對γ-干擾素上清液進(jìn)行檢測。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性=牛型提純結(jié)核菌素的OD-陰性抗原的OD＜0.1或牛型提純結(jié)核菌素的OD-禽型提純結(jié)核菌素的OD＜0.1。陽性=牛型提純結(jié)核菌素的OD-陰性抗原的OD≥0.1且牛型提純結(jié)核菌素的OD-禽型提純結(jié)核菌素的OD≥0.1。

2 結(jié)果

（1）牛型提純結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)選定永靖縣39個(gè)奶牛養(yǎng)殖場（戶）飼養(yǎng)的531頭奶牛進(jìn)行結(jié)核病檢疫凈化，每年3～4月份和9～10月份分為兩次進(jìn)行集中檢測，累計(jì)檢測3140頭次。檢出疑似陽性牛11頭，在頸部對側(cè)復(fù)檢的同時(shí)，采集血液樣本。通過皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法復(fù)檢排除疑似陽性牛4頭，實(shí)際陽性牛為7頭，奶牛結(jié)核陽性率0.22%。（詳見表1）

表1 2014～2016年全縣奶牛結(jié)核病檢測統(tǒng)計(jì)表 單位：頭、%

（2）牛結(jié)核γ-干擾素檢測試驗(yàn)

通過牛結(jié)核γ-干擾素檢測技術(shù)對11頭疑似陽性牛進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測，排除假陽性奶牛6頭，最終確定結(jié)核陽性牛5頭，奶牛結(jié)核陽性率0.16%。

表2 γ-干擾素技術(shù)與PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)技術(shù)的比較

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：γ-干擾素試驗(yàn)與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)相比，特異性好和靈敏度高，但是該方法成本較高，目前不適合全面推廣使用。國內(nèi)已經(jīng)開始研發(fā)低成本的γ-干擾素牛結(jié)核病診斷試劑盒，該試劑盒研發(fā)成功后將改變我國牛結(jié)核病的診斷方法。

4 結(jié)論

γ-干擾素檢測技術(shù)是一種新型牛結(jié)核病檢測方法，具有檢測結(jié)核病早期感染的能力，通過體外刺激培養(yǎng)，檢測只需要采集一次血樣，而且試驗(yàn)特異性好，檢測敏感性高。商品化牛結(jié)核下γ-干擾素試驗(yàn)試劑盒，容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，排除了PPD變態(tài)反應(yīng)結(jié)果判定人為因素影響。但是牛結(jié)核分枝桿菌下一干擾素檢測試劑盒價(jià)格較高，建議目前將該方法用于復(fù)核檢查牛型PPD變態(tài)反應(yīng)陽性牛，剔除部分假陽性牛型PPD反應(yīng)，盡量減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失。