李善華，黃 萍，陳 琴，何華瓊

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紅景天苷對博萊霉素誘導大鼠肺纖維化后VEGF及MMP表達的影響

李善華1a，黃 萍1b，陳 琴1a，何華瓊2*

目的 觀察紅景天苷對大鼠肺纖維化動物模型肺組織血管內皮生長因子(VEGF)及基質金屬蛋白酶(Matrix Metalliproteinase，MMP)表達的影響，探討其作用機制。方法 Wistar大鼠36只，隨機分為對照組、模型組、紅景天苷組。模型組和紅景天苷組經(jīng)氣管內注射博萊霉素誘導大鼠肺纖維化，對照組注射等體積生理鹽水。1周后紅景天苷組經(jīng)尾靜脈注射1%紅景天苷2 mL/(kg·d)，1次/d，連續(xù)注射治療14 d；對照組、模型組給予等體積生理鹽水。采用ELISA法檢測大鼠肺組織VEGF蛋白，采用反轉錄聚合酶鏈反應法測定其VEGF-mRNA表達，免疫組織化學染色法檢測大鼠肺組織中MMP (MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13)與金屬蛋白酶組織抑制劑-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)表達，并檢測外周血超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)水平。結果 治療14 d后，紅景天苷組VEGF蛋白及VEGF-mRNA、TIMP-1、外周血 SOD 及CAT升高，MMP-2、MMP-9表達降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 紅景天苷可上調肺纖維化模型大鼠肺組織VEGF蛋白及VEGF-mRNA的表達，增強SOD及CAT酶活性，減輕血管內皮炎癥反應造成的纖維增生，調節(jié)MMP-2、MMP-9及TIMP-1的平衡，抑制博萊霉素誘導肺纖維化病理改變和進程。

紅景天苷；肺纖維化；血管內皮生長因子；基質金屬蛋白酶；金屬蛋白酶組織抑制劑-1

0 引言

肺纖維化屬“喘癥、肺痿”范疇，病因復雜多樣，以肺成纖維細胞增殖及肺泡間質性炎癥為主，病理特點是長期慢性肺部炎癥及肺泡持續(xù)性損傷導致細胞外基質金屬蛋白酶(Matrix Metalliproteinase，MMP)聚集，特別是MMP-2、MMP-9異常增多，金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)降低，使其平衡關系破壞，導致肺大量細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)聚集，組織細胞重構和膠原過度沉積[1]。同時可能抑制組織VEGF表達，降低肺微、小靜脈血管的通透性，抑制血管內皮細胞分裂增殖及血管再生[2]，加重肺組織損傷，并最終導致彌漫性肺間質疾病-肺纖維化。目前無有效的抗纖維化藥物，常用糖皮質激素抗炎以降低抗纖維化進程，但療效有限。有研究表明，紅景天具有扶正固本、清熱潤肺、補氣養(yǎng)血之功效，對器官纖維化和肺損傷有一定的防治作用[3]，但是否具有治療肺纖維化的藥理作用尚未明確。本研究采用免疫組化方法，觀察博萊霉素誘導建立大鼠肺纖維化模型肺組織中的血管內皮生長因子(VEGF)蛋白及VEGF-mRNA表達、MMP亞型及其抑制劑TIMP-1的變化，以分析紅景天苷對大鼠肺纖維化病理改變的干預作用，為其可能用于臨床治療及預防肺纖維化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 Wistar大鼠36只，SPF級，雌雄各半，鼠齡50～55 d，體重(180±20) g，實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2011-0008。采用隨機數(shù)字表編號后隨機分為對照組、模型組、紅景天苷組，每組12只。動物房濕度控制在50%～75%，溫度18～25 ℃，動物自由飲水，分籠飼養(yǎng)，自然光照，普通飼料喂養(yǎng)。本研究中實驗動物由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，動物處置方法均符合動物倫理學及實驗動物福利標準[4]。

1.2 藥品與試劑 紅景天苷粉(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，10 mg/瓶，批號：GR0532)，使用前用蒸餾水配制成1%溶液，保存于4 ℃冰箱備用。博萊霉素(日本株式會社)，使用前用生理鹽水稀釋成0.5 U/mL溶液于4 ℃冰箱暫存?zhèn)溆?。鼠抗鼠MMP單克隆抗體(NEO Mark-ers公司提供)，鼠抗鼠TIMP-1多克隆抗體(武漢博士德公司提供)，大鼠VEGF試劑盒、提取mRNA試劑及反轉錄試劑(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3 大鼠肺纖維化模型造模及給藥方法 參照文獻[5]，所有動物在造模前夜均停止喂食，不禁水，2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于小動物手術臺，碘伏消毒后無菌操作，切開大鼠頸部皮膚后，用玻璃分針鈍性分離大鼠氣管，用5 mL注射器將配制好的0.5 U/mL博萊霉素溶液(5 mg/kg)經(jīng)氣管灌入模型組和紅景天苷組，對照組灌入等體積生理鹽水，灌入后立即將大鼠頭上尾下直立并左右旋轉大鼠，使藥物均勻灌入動物雙肺，縫合頸部皮膚，再用碘伏消毒。本造模方法簡單，成功率達100%。造模后1周，紅景天苷組大鼠經(jīng)尾靜脈注射1%紅景天苷溶液2 mL/(kg·d)，按此劑量連續(xù)預處理14 d，對照組及模型組注射等量生理鹽水對照。

1.4 檢測指標及方法 三組動物分別于造模后和治療14 d時經(jīng)尾靜脈取外周靜脈血，檢測外周血超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)水平。參照文獻[6]，三組大鼠取血后分2次斷頭處死(造模后和治療14 d，每組6只)，剪開胸腔，先取動物右肺組織于-4 ℃冰箱暫存，以備VEGF檢測。之后結扎右側主支氣管，用4%多聚甲醛灌入氣管內至左肺膨脹，邊緣變銳、胸膜平展后結扎左主支氣管，將肺組織標本置于4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后取左側肺常規(guī)石蠟包埋、切片，用免疫組織化學染色法觀察大鼠肺組織中MMP亞型及TIMP-1表達。檢測VEGF時，先暫存右肺組織，研磨、組織勻漿，以3 000 r/min高速離心，取上清液，嚴格按SP試劑盒說明操作，采用ELISA法檢測肺組織VEGF蛋白，應用反轉錄聚合酶鏈反應法測定其VEGF-mRNA表達。

2 結果

2.1 紅景天苷對大鼠肺組織MMP的影響 見表1。對照組、模型組及紅景天苷組的TIMP-1分別為8.75±0.67、5.72±0.43、8.17±0.56。對照組大鼠肺組織MMP亞型及TIMP-1均有少量表達，在造模及治療14 d后保持在相對平衡狀態(tài)。模型組大鼠MMP-2、MMP-3、MMP-9表達在造模及治療14 d后均升高，TIMP-1降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療14 d后，紅景天苷組的MMP-2、MMP-9表達降低，TIMP-1表達上調，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 紅景天苷對大鼠肺組織VEGF蛋白及VEGF-mRNA表達的影響 見表2。造模及治療14 d后，對照組大鼠肺組織VEGF蛋白及VEGF-mRNA表達無明顯變化(P>0.05)；模型組VEGF蛋白、VEGF-mRNA表達明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療14 d后，紅景天苷組VEGF蛋白及VEGF-mRNA表達增強，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 紅景天苷對大鼠外周血SOD、CAT酶活性的影響 見表3。造模及治療14 d后，對照組大鼠外周血SOD、CAT酶活性均無明顯變化(P>0.05)。治療14 d后，模型組大鼠外周血SOD、CAT酶活性降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；紅景天苷組大鼠外周血SOD、CAT酶活性增強，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 大鼠肺組織MMP比較(ng/L)

注：*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

表2 大鼠肺組織VEGF蛋白及VEGF-mRNA表達比較

注：*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

表3 大鼠外周血SOD、CAT水平比較

注：*與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05

3 討論

紅景天主要產(chǎn)于高寒地帶，西藏、青海、四川、東北三省等均有種植，屬景天科植物，其藥性寒、味甘澀，歸脾肺經(jīng)[7]，《神農(nóng)本草經(jīng)》譽其為“高原人參”、“東方神草”[8]，以藏紅景天為上品。藥用其根莖，后者富含紅景天苷、沒食子酸、二苯甲基六氫、β-谷甾醇吡啶等多種有機化合物[9]。紅景天苷(Salidroside，SAL)是其主要有效成分，具有滋補壯陽、抗缺氧及消除疲勞的作用[10]，可增強組織耐缺氧，提高免疫力，抑制脂質過氧化，清除組織氧自由基，還具有上調缺血組織VEGF蛋白及VEGF-mRNA表達的作用[11]。

本研究中，治療后，模型組大鼠VEGF蛋白及VEGF-mRNA、TIMP-1、外周血 SOD 及CAT明顯降低，各視野MMP-2、MMP-9表達增強，說明博萊霉素誘導大鼠肺纖維化病理改變成功，肺纖維化VEGF蛋白及VEGF-mRNA、MMP-2、MMP-9過度表達，MMP-2、MMP-9與TIMP-1失衡密切相關。與模型組比較，紅景天苷組VEGF蛋白及VEGF-mRNA、TIMP-1、外周血SOD及CAT明顯升高，各視野MMP-2、MMP-9表達降低。VEGF蛋白及VEGF-mRNA表達上調，提示紅景天苷具有促進肺纖維化后大鼠VEGF分泌的作用，與石惠榮等[12]研究結果(紅景天注射液誘導缺血心肌的血管再生、促進受損血管內皮修復的功能)相似。賈鳳玖等[13]研究顯示，紅景天可增強血管Na+-K+-ATP酶活力，阻止Ca2+內流，減少細胞內鈣超載而改善組織能量代謝，誘導缺血組織血管再生、改善微循環(huán)而起組織保護作用。本實驗中，VEGF蛋白及VEGF-mRNA表達上調是否與之有關無直接證據(jù)。肺纖維化時，肺泡間質性炎癥，成纖維細胞增殖，大量細胞外ECM聚集，由于ECM反復破壞、修復、重構和膠原過度沉積造成肺纖維化。而MMP中MMP-2、MMP-9與TIMP-1是降解ECM的一組特異酶，其比例失衡是造成肺纖維化發(fā)生及發(fā)展的關鍵，MMP-2、MMP-9增加時ECM降解作用也增強，此降解病理過程會造成肺組織的損傷，觸發(fā)肺纖維化[14]。紅景天苷組TIMP-1活性增強，MMP-2、MMP-9表達降低，說明紅景天苷可增強TIMP-1活性，抑制MMP-2、MMP-9的合成與活化，使纖維化期MMP-2、MMP-9與TIMP-1失衡得以恢復，間接降低ECM降解，延緩甚至抑制纖維化進程。另外，機體氧自由基的生成與清除處于動態(tài)平衡中，血管內皮及功能正常，當組織纖維化病理改變時，MMP-2、MMP-9與TIMP-1失衡造成的肺纖維化可能導致組織灌注不足，機體SOD、CAT等自由基清除酶活性急劇降低，造成自由基清除酶對氧自由基清除能力下降，加重肺纖維化進程[15]。機體在發(fā)生脂質過氧化反應時，產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物過氧化氫對組織器官造成嚴重損害，而CAT可清除體內過氧化氫，SOD也可減輕組織細胞避免受過氧化氫的損害[16-18]。本研究顯示，紅景天苷明顯增強SOD、CAT酶活性，說明其可增強SOD、CAT等自由基清除活性酶的活性，抑制有害代謝產(chǎn)物過氧化氫造成的脂質過氧化反應，間接降低肺纖維化對肺組織的破壞。

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Effect of salidroside on the expression of VEGF and MMP in rats with bleomycin induced pulmonary fibrosis

LI Shan-hua1a,HUANG Ping1b,CHEN Qin1a,HE Hua-qiong2*

(1.a.Department of Respiratory,b.Department of Dermatology,Shiyan Taihe Hospital,the Affiliated Hospital of Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;2.Department of Internal Medicine,Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

Objective To observe the effect of salidroside on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinases (MMP) in rat model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis,and explore the mechanism.Methods Totally 36 Wistar rats were randomly assigned to control group,model group and salidroside group.Rats in model group and salidroside group were injected with bleomycin via the tail vein to induce pulmonary fibrosis,and rats in control group were injected with equal volume of saline.Rats in salidroside group were injected with 1% salidroside 2 mL/(kg·d) via the tail vein (once daily) after 1 week for 14 d,while rats in control group and model group were given the same volume of normal saline.The VEGF protein in lung tissue was measured by ELISA,and the expression of VEGF mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction method.The expression of MMP (MMP subtype included MMP-1,MMP-2,MMP-3,MMP-9 and MMP-13) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in the lung tissue of rats was detected by immunohistochemical staining,and the levels of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in peripheral blood were determined.Results The VEGF protein,VEGF-mRNA,TIMP-1,SOD and CAT in peripheral blood increased significantly (P<0.05) after 14 d treatment,while the expression of MMP-2 and MMP-9 decreased (P<0.05).Conclusion Salidroside can up-regulate the expression of VEGF protein and VEGF mRNA,enhance the activity of SOD and CAT enzyme,reduce the fiber hyperplasia induced by vascular endothelial inflammatory response,regulate the balance of MMP-2,MMP-9 and TIMP-1,and inhibit the pathological changes and processes of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Salidroside;Pulmonary fibrosis;Vascular endothelial growth factor;Matrix metalloproteinases (MMP);Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1)

2016-04-19

1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)，a.呼吸內科，b.皮膚科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院機能實驗室，湖北 十堰 442000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201611005