朱　華，李一林，趙傳科，解清華，，劉　菲，韓雪迪，高　靜，夏傳琴，沈　琳，楊　志

（1.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所核醫(yī)學(xué)科，2.消化腫瘤內(nèi)科，3.生化與分子生物學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100142；4.四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，成都610041）

64Cu?NOTA?Herceptin的設(shè)計(jì)、活性測(cè)定及腫瘤靶向分子顯像研究

朱華1，李一林2，趙傳科3，解清華1，4，劉菲1，韓雪迪1，高靜1，夏傳琴4，沈琳2，楊志1

（1.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所核醫(yī)學(xué)科，2.消化腫瘤內(nèi)科，3.生化與分子生物學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100142；4.四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，成都610041）

利用雙功能螯合劑2?［（4?異硫氰基苯基）甲基］?1，4，7?三氮雜環(huán)九烷?1，4，7?三乙酸（NCS?Bz?NOTA）對(duì)Herceptin單抗表面的氨基進(jìn)行修飾獲得了NOTA?Herceptin，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI?TOF）對(duì)該偶聯(lián)物進(jìn)行了表征.利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定了偶聯(lián)前后Herceptin抗體效價(jià)的改變.利用新型正電子核素64Cu標(biāo)記，獲得可用于腫瘤放射靶向精準(zhǔn)診療的64Cu?NOTA?Herceptin探針，其標(biāo)記率為90％，放化純度＞98％，比活度185 MBq／nmol.分別進(jìn)行了該探針在HER2過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞NCI?N87及HER2低表達(dá)胃癌細(xì)胞BGC823等腫瘤細(xì)胞中的攝取實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了該探針的腫瘤特異性.建立了荷人胃癌BGC823裸鼠模型，通過(guò)微型正電子斷層顯像（Micro?PET）設(shè)備觀察了探針在模型動(dòng)物體內(nèi)的代謝情況：在靜脈注射7.4 MBq64Cu?NOTA?Herceptin探針后，分別于4和60 h進(jìn)行正電子斷層顯像（PET）的顯像，觀察到其在腫瘤部位的攝取有所富集，且隨著代謝時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟部位攝取得到明顯降低.研究結(jié)果表明，64Cu?NOTA?Herceptin探針有望應(yīng)用于腫瘤放射性靶向診療.

曲妥珠單抗；64Cu；免疫活性；分子顯像；腫瘤靶向診療

胃癌是亞洲的“專屬癌癥”.胃癌難以診斷，超過(guò)一半患者因在確診時(shí)即為晚期而失去手術(shù)機(jī)會(huì).以藥物治療為主的綜合治療仍為目前晚期胃癌治療的主要手段.然而，迄今為止，化療藥物在胃癌治療中的有效率非常有限，且毒副作用大［1］.

以單克隆抗體為代表的腫瘤分子靶向治療日益成為腫瘤治療的重要手段.目前已有多種單抗應(yīng)用于腫瘤靶向治療.但對(duì)于胃癌，單抗靶向治療進(jìn)展仍較滯后.2010年，國(guó)際多中心Ⅲ期臨床研究結(jié)果顯示，以人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）為靶點(diǎn)的曲妥珠單抗（Herceptin）聯(lián)合化學(xué)治療對(duì)HER2過(guò)表達(dá)的晚期胃癌與單純化療相比，明顯延長(zhǎng)總生存期（OS）［2，3］.由此，Herceptin成為首個(gè)并且迄今唯一在晚期胃癌一線治療中確認(rèn)有生存獲益的靶向藥物，突破性地提高了胃癌治療水平［4］.Herceptin單抗能夠靶向結(jié)合胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞膜表面的HER2受體，抑制下游相關(guān)信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移.同時(shí)，Herceptin結(jié)合HER2受體可以啟動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行腫瘤細(xì)胞殺傷.但該多中心研究結(jié)果同時(shí)顯示，HER2過(guò)表達(dá)晚期胃癌患者抗HER2靶向治療客觀有效率僅為47.3％.即使初期有效，最終也出現(xiàn)惡性腫瘤復(fù)發(fā)及耐藥性［5］.此外，Herceptin單抗自身具有較強(qiáng)的心臟毒副作用.不僅如此，單克隆抗體在惡性腫瘤的靶向治療中還表現(xiàn)出高度異質(zhì)性［6］.如組織學(xué)HER2表達(dá)陽(yáng)性患者可從Herceptin抗HER2的靶向治療中獲益.因此，實(shí)現(xiàn)靶向藥物在腫瘤治療中的個(gè)體化治療、精準(zhǔn)治療成為腫瘤診療領(lǐng)域值得關(guān)注的問(wèn)題.分子影像診斷以人全身為探求對(duì)象，將腫瘤影像診斷提高到腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的分子水平［7］.而快速、精準(zhǔn)、無(wú)創(chuàng)、有效評(píng)價(jià)腫瘤靶向治療藥物效果的分子探針的出現(xiàn)，將有望解決腫瘤異質(zhì)性問(wèn)題.

本團(tuán)隊(duì)曾將Herceptin修飾后與99mTc標(biāo)記，獲得99mTc?Herceptin探針，可針對(duì)全身系統(tǒng)HER2的表達(dá)情況無(wú)創(chuàng)顯像.但由于99mTc（半衰期T1／2＝6.9 h）是單光子核素，標(biāo)記獲得的99mTc?Herceptin空間分辨率較低、半衰期偏短，難以觀察到48 h后探針在體內(nèi)的代謝情況.2010年，Dijkers等［8］利用89Zr?Herceptin探針進(jìn)行HER2陽(yáng)性乳腺癌轉(zhuǎn)移灶的正電子斷層顯像（PET）研究，取得了較好的效果，也觀察到其在心臟明顯的高攝?。ǜ哂诟文I臟系統(tǒng)）.新型核素64Cu（半衰期T1／2＝12.7 h）具有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，能夠長(zhǎng)時(shí)間、高分辨率地檢測(cè)探針在體內(nèi)的代謝情況，其產(chǎn)生的β－粒子具有放射治療的效果［9］.Tamura等［10］制備出64Cu?DOTA?Herceptin，并進(jìn)行了6例乳腺癌患者的PET／CT顯像研究，該研究能夠有效區(qū)分出HER2陽(yáng)性乳腺癌的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶，且輻射劑量及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)均能符合PET／CT顯像要求.

本文參照文獻(xiàn)［11，12］方法，將Herceptin表面氨基在溫和的條件下與2?［（4?異硫氰基苯基）甲基］?1，4，7?三氮雜環(huán)九烷?1，4，7?三乙酸（NCS?Bz?NOTA）偶聯(lián)，合成了具有HER2靶向的新型腫瘤顯像劑前體NOTA?Herceptin.而后利用64Cu進(jìn)行放射性標(biāo)記，獲得64Cu?NOTA?Herceptin.分別選用HER2高表達(dá)人胃癌細(xì)胞株NCI?N87及HER2低表達(dá)人胃癌BGC823細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，并建立了荷人胃癌BGC823裸鼠模型，靜脈注射7.4 MBq64Cu?NOTA?Herceptin后進(jìn)行Micro?PET顯像研究，結(jié)果表明，標(biāo)記獲得的單抗基本保持原有的生物學(xué)活性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

NCS?Bz?NOTA購(gòu)自Macro?cyclies公司；N，N?二甲基甲酰胺（DMF）購(gòu)于西格瑪公司（St.Louis，MO）；64Cu由北京腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供；醋酸鈉（NaAc）購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司；氯化鈉、氯化鉀等購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SPF級(jí)BALB／c裸鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司）；自制磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol／L，pH＝7.4）.

Nanodrop 2000型紫外分光光度計(jì)（UV?Vis，美國(guó)雷諾公司）；PD?10蛋白分離柱（美國(guó)GE公司）；1200系列高效液相色譜儀（HPLC，美國(guó)安捷倫公司），紫外檢測(cè)器吸收峰設(shè)為280 nm；SEC?3凝膠色譜柱（150 A，300 mm×7.8 mm，美國(guó)安捷倫公司），以0.01 mol／L PBS溶液為緩沖液，等梯度淋洗，流速1.0 mL／min；Radio?TLC放射性薄層掃描儀（德國(guó)默克公司），使用ITLC?SG硅膠板，配備Bioscan AR?2000系統(tǒng).放射性活度經(jīng)多探頭全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器［3?in，NaI（Tl）井型探測(cè)器］計(jì)量.Micro?PET顯像結(jié)果通過(guò)SuperArgus系統(tǒng)采集，顯像時(shí)間為15 min，所得數(shù)據(jù)用Sedecal 3D OSEM系統(tǒng)分析處理.

1.2 NOTA?Herceptin的合成及MALDI?TOF分析和生物活性檢測(cè)

Herceptin單抗的修飾過(guò)程見(jiàn)圖1.先將Herceptin單抗經(jīng)過(guò)PD?10純化，而后取200 μL Herceptin單抗，向其中加入8倍量的NCS?Bz?NOTA雙功能螯合劑，于4℃下振蕩4 h.通過(guò)PD?10柱純化后，用UV?Vis及HPLC分析，獲得可用于核素標(biāo)記的NOTA?Herceptin標(biāo)記前體.

Fig．1 Modification of Herceptin antibody and radiolabeling methodology of64Cu radionuclide

通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離分行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI?TOF）技術(shù)測(cè)定Herceptin修飾前后的分子量.通過(guò)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法檢測(cè)NOTA?Herceptin與HER2抗原結(jié)合活性來(lái)測(cè)定NOTA?Herceptin的生物學(xué)活性.用包被液將重組人HER2蛋白稀釋至2.5 μg／mL，加入96孔酶標(biāo)板（100μL／孔），于4℃下放置過(guò)夜；洗板3次后，加入200 μL 50 g／L BSA封閉液，于37℃封閉1 h；洗板3次后，將Herceptin及NOTA?Herceptin倍比稀釋，并將不同濃度梯度Herceptin及NOTA?Herceptin加入酶標(biāo)板中（100 μL／孔），同時(shí)加入稀釋液為空白對(duì)照，于37℃下孵育1 h；洗板3次后，移取辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗人IgG抗體（1∶1000稀釋，100 μL／孔），于37℃孵育30 min后洗板6次，加入3，3′，5，5′?四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液，于37℃孵育15 min顯色后，加入50 μL／孔終止液，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度值.

1.364Cu?NOTA?Herceptin的質(zhì)量控制及細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

1.3.1 新型核素64Cu的放射性標(biāo)記 向20 μL（3.7 MBq／μL）64CuCl2溶液中先后加入0.2 mL 0.1 mol／L（pH＝5.5）的NaAc緩沖液和100 μL NOTA?Herceptin，反應(yīng)30 min后進(jìn)行Radio?HPLC測(cè)定，衰變校正后計(jì)算放化產(chǎn)率.經(jīng)Radio?HPLC對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物64Cu?NOTA?Herceptin的放射性峰進(jìn)行面積積分，計(jì)算放化純度.

1.3.2 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行64Cu?NOTA?Herceptin標(biāo)記化合物在NCI?N87及BGC823細(xì)胞株中的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，并在NCI?N87細(xì)胞的阻斷組中加入0.1 mg Herceptin／孔的阻斷劑，評(píng)價(jià)其作為受體顯像劑的活性劑特異性.具體操作參考文獻(xiàn)［13］方法并進(jìn)行調(diào)整.在96孔板中，向每個(gè)孔中加入37 kBq的64Cu?NOTA?Herceptin，收集其在2種細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)的攝取數(shù)據(jù).將所有試管的放射性含量通過(guò)γ?計(jì)數(shù)器讀取.

1.464Cu?NOTA?Herceptin的Micro?PET顯像觀察

Micro?PET具有較高的空間分辨率（可達(dá)1 mm），可以準(zhǔn)確反映藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝.本文通過(guò)Micro?PET設(shè)備觀察64Cu?NOTA?Herceptin探針標(biāo)記在腫瘤鼠體內(nèi)的攝取情況.取BALB／c裸鼠（10周齡），在其右前下肢前部植入直徑約0.8 cm的人胃癌細(xì)胞BGC823種植瘤.注射前禁食12 h，通過(guò)尾靜脈注射7.4 MBq的64Cu?NOTA?Herceptin，分別于注射后4和60 h進(jìn)行Micro?PET顯像.裸鼠在Summit AS小動(dòng)物麻醉系統(tǒng)中用混有3％（體積分?jǐn)?shù)）異氟烷的氧氣麻醉，顯像過(guò)程維持含1％～1.5％（體積分?jǐn)?shù)）異氟烷的氧氣麻醉.Micro?PET顯像結(jié)果通過(guò)SuperArgus系統(tǒng)采集，顯像時(shí)間為15 min，所得數(shù)據(jù)用Sedecal 3D OSEM系統(tǒng)分析處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 NOTA?Herceptin的合成及活性測(cè)定

2.1.1 NOTA?Herceptin的偶聯(lián)及MALDI?TOF分析 Herceptin單抗是IgG型單抗，表面含有大量裸露的氨基，具有良好的化學(xué)修飾活性.在偶聯(lián)之前使用PD?10柱以0.01 mol／L（pH＝7.4）經(jīng)過(guò)Chelex 100處理的、無(wú)金屬離子的PBS純化收集，通過(guò)UV?Vis光譜測(cè)得純化后其濃度為2.57 mg／mL（17.13 nmol／L），并通過(guò)MALDI?TOF測(cè)定其分子量為148325.2.在偶聯(lián)過(guò)程中，為了保持單抗免疫活性，在4℃時(shí)，選用8.0倍摩爾數(shù)的NCS?Bz?NOTA作為雙功能螯合劑，在0.1 mol／L（pH＝8.2）NaHCO3溶液反應(yīng)體系中，用HPLC的紫外分析監(jiān)測(cè)反應(yīng)至完成.而后用PD?10柱純化未偶聯(lián)的NCS?Bz?NOTA.即可獲得可用于放射性核素標(biāo)記的NOTA?Herceptin.測(cè)定其化學(xué)濃度為1.22 mg／mL（8.13 nmol／L），通過(guò)HPLC測(cè)定其化學(xué)純度大于98％，并通過(guò)MALDI?TOF測(cè)定其實(shí)測(cè)分子量為150839.2（圖2）.偶聯(lián)前后分子量差為2514.0，雙功能螯合劑NCS?Bz?NOTA的分子量為465，因此每個(gè)單抗分子上約偶聯(lián)有5.4個(gè)NOTA分子.

Fig．2 TMALDI?TOF mass spectrum analysis of Herceptin（A）and NOTA?Herceptin（B）

2.1.2 NOTA?Herceptin的生物學(xué)活性檢測(cè) 通常，每個(gè)單抗偶聯(lián)2～5個(gè)雙功能螯合劑能夠較好地保持原有活性.偶聯(lián)前后的Herceptin的濃度通過(guò)BCA法檢測(cè)并歸一化，并通過(guò)ELISA檢測(cè)偶聯(lián)前后Herceptin不同濃度梯度下與重組HER2蛋白的特異性結(jié)合能力，結(jié)果如圖3所示.相比于偶聯(lián)前的Herceptin，NOTA?Herceptin與重組HER2蛋白抗原特異性結(jié)合能力僅在高濃度下略有下降，而總體上，偶聯(lián)前后Herceptin的效價(jià)無(wú)明顯降低，說(shuō)明在研究反應(yīng)體系中，NOTA?Herceptin的生物學(xué)活性可以有效保持，有利于其進(jìn)一步的體內(nèi)靶向成像研究.

Fig．3 Biological activity of Herceptin before（a）and after（b）NOTA modification tested by ELISA

2.264Cu?NOTA?Herceptin的質(zhì)量控制及細(xì)胞攝取

2.2.1 新型核素64Cu的放射性標(biāo)記64Cu既能夠進(jìn)行PET診斷，又能進(jìn)行核素治療.64Cu2＋外層軌道上電子的排布決定了其易于與含氮、硫、氧等原子的配體形成較穩(wěn)定的配合物.在本研究中選用NOTA作為64Cu的螯合基團(tuán)，與常用的DOTA相比，NOTA具有更好的穩(wěn)定性［12］.

2.2.264Cu?NOTA?Herceptin的質(zhì)量控制 由于單抗的分子量較大，約為1.5×105.偶聯(lián)上的核素64Cu分子量?jī)H為64，而NOTA的分子量?jī)H為單抗分子量的1／2000，幾乎不對(duì)單抗性質(zhì)產(chǎn)生影響.條件優(yōu)化后，放射性標(biāo)記率達(dá)96％，經(jīng)PD?10柱純化，獲新型分子探針64Cu?NOTA?Herceptin，Radio?HPLC測(cè)定其放化純度＞99％.

2.2.364Cu?NOTA?Herceptin的細(xì)胞攝取 為了測(cè)定修飾后64Cu?NOTA?Herceptin探針是否保持原有生物學(xué)活性劑特異性，選取HER2低表達(dá)的BGC823細(xì)胞和HER2高表達(dá)的NCI?N87細(xì)胞，測(cè)定在不同時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞攝取情況，以確定腫瘤攝取率與結(jié)合時(shí)間的關(guān)系.如圖4所示，64Cu?NOTA?Herceptin探針在HER2低表達(dá)的BGC823腫瘤細(xì)胞中的攝取隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加.在HER2高表達(dá)NCI?N87細(xì)胞中，NOTA?Herceptin在NCI?N87細(xì)胞中的攝取同樣隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且其在NCI?N87細(xì)胞中的攝取效率及攝取速度明顯比在HER2低表達(dá)的BGC823細(xì)胞中的高.而在使用Herceptin封閉HER2位點(diǎn)的NCI?N87細(xì)胞中（Block），2 h時(shí)的細(xì)胞攝取效率則顯著下降.這一結(jié)果說(shuō)明，NOTA?Herceptin的細(xì)胞攝取是基于其與HER2受體的特異性結(jié)合，NOTA?Herceptin具有特異性的HER2受體靶向結(jié)合成像潛力.

Fig．464Cu?NOTA?Herceptin cell uptake in HER2 negative BCG823（A）and HER2 positive NCl?N87（B）（A）Uptake time／min：a.0；b.5；c.30；d.60；（B）uptake time／min：a.0；b.5；c.30；d.60；e.120；f.120（block group）.

由初步體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，64Cu?NOTA?Herceptin探針在2種細(xì)胞中的攝取均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，表明該探針具有生物學(xué)活性，能夠通過(guò)細(xì)胞表面的受體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部；且在HER2高表達(dá)NCI?N87細(xì)胞中的攝取速度更快，在開(kāi)始（0 min）時(shí)攝取速度一致，但在5 min時(shí)為BGC823細(xì)胞攝取速度的8倍.更值得說(shuō)明的是，NCI?N87細(xì)胞對(duì)NOTA?Herceptin的攝取能夠被過(guò)量的Herceptin阻斷，其具有保持HER2受體的特異性.體外腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，64Cu?NOTA?Herceptin具有生物學(xué)活性和特異性.

2.364Cu?NOTA?Herceptin的Micro?PET顯像分析

在本研究中，選右側(cè)腋下荷胃癌BGC823細(xì)胞模型的裸鼠進(jìn)行Micro?PET顯像研究，腫瘤直徑約0.8 cm.如圖5所示，在尾靜脈注射7.4 MBq的64Cu?NOTA?Herceptin 4 h后，其在腫瘤部位有所富集，由于腫瘤偏大，在腫瘤內(nèi)部有壞死組織，因此，在Micro?PET圖像中表現(xiàn)出腫瘤表面的攝取.在4 h時(shí)，64Cu?NOTA?Herceptin在心臟及肝臟中出現(xiàn)明顯的代謝富集.在經(jīng)靜脈注射60 h后，探針在動(dòng)物體內(nèi)的非特異性代謝逐漸被清除，在心臟中可見(jiàn)少量放射性殘留，在肝臟中的攝取明顯降低.探針在BGC823腫瘤中的攝取與4 h時(shí)的相比有所提高.另外，隨著代謝時(shí)間的延長(zhǎng)，64Cu?NOTA?Herceptin在BGC823腫瘤中表現(xiàn)出一定程度的富集，60 h后該探針在腫瘤部位的富集有所增加，而在心臟、腎臟的攝取逐步降低.

Fig．5 Micro?PET imaging of BGC823 tumor?bearing nude miceRed arrow indicates tumors.（A）4 h PET imaging；（B）60 h PET imaging.

Fig．6 Micro?PET imaging of human gastric BGC823 tumor?bearing nude mice（A）Sagittal，4 h；（B）coronal，4 h；（C）transverse，4 h；（D）sagittal，60 h；（E）coronal，60 h；（F）trans?verse，60 h.

為了能夠更好地了解64Cu?NOTA?Herceptin在模型動(dòng)物體內(nèi)的分布，通過(guò)Micro?PET進(jìn)行斷層顯像分析.如圖6所示，從4 h開(kāi)始，在特定的角度（橫斷面、冠狀面、矢狀面）均能夠觀察到腫瘤部位有64Cu?NOTA?Herceptin的攝取.且隨著時(shí)間延長(zhǎng)至60 h時(shí)，腫瘤對(duì)該探針的攝取明顯增加，且探針主要分布在腫瘤的外周組織.

3 結(jié) 論

通過(guò)選用具有HER2靶向性的Herceptin單抗進(jìn)行化學(xué)修飾獲得NOTA?Herceptin前體，通過(guò)ELISA檢測(cè)偶聯(lián)前后Herceptin的抗體效價(jià)變化，確認(rèn)其基本保持原有活性.而后進(jìn)行新型放射性診療核素64Cu的標(biāo)記，獲得64Cu?NOTA?Herceptin探針并進(jìn)行質(zhì)量控制.該探針的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí)，標(biāo)記后的探針依然保留原有的生物學(xué)活性劑特異性.而后靜脈注射64Cu?NOTA?Herceptin探針，通過(guò)Micro?PET設(shè)備觀察到其在BGC823腫瘤中表現(xiàn)出明顯攝取.本文研究結(jié)果表明，新型64Cu?NOTA?Herceptin探針有望用于腫瘤靶向治療的療效檢測(cè)及個(gè)體化治療.

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（Ed.：F，K，M）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.81371592，81401467，81501519，81301323，81571705）and the Natural Science Foundation of Beijing，China（Nos.7154185，7162041）.

Design and Bio?evaluation of64Cu?NOTA?Herceptin for Tumor Targeted Micro?PET Imaging?

ZHU Hua1，LI Yilin2，ZHAO Chuanke3，XIE Qinghua1，4，LIU Fei1，HAN Xuedi1，GAO Jing2，XIA Chuanqin4，SHEN Lin2?，YANG Zhi1?
（1．Department of Nuclear Medicine，2．Department of Gastrointestinal Oncology，3．Departments of Biochemistry and Molecular Biology，Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research（Ministry of Education），Peking University Cancer Hospital＆Institute，Beijing 100142，China；4．College of Chemistry，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

The precursor compound 2?（p?thiocyanatobenzyl）?1，4，7?triazacyclononane?1，4，7?triacetic acid?Herceptin（NOTA?Herceptin）was synthesized by the nucleophilic addition reaction of Herceptin and bi?func?tional chelator NCS?Bz?NOTA.The original Herceptin and NOTA?Herceptin conjugate were investigated by UV?Vis and MALDI?TOF mass spectra.The average number of chelators per Herceptin for the conjugated used in this study was 5.4.The enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to compare the biolog?ical activity of original Herceptin and NOTA?Herceptin.NOTA?Herceptin kept high immunoreactivity towards HER2 antigen.Then，the PET radio?nuclide64Cu（T1／2＝12.7 h）was labeled to got the novel tumor Immuno?Theranostics probe64Cu?NOTA?Herceptin.The labeling efficiency of64Cu?NOTA?Herceptin was tested by Ra?dio?TLC／HPLC.The radiolabeling yield was over 90％，the radio chemical purity was over 98％after PD?10 column purification and the specific activity was 185 MBq／nmol.The immune reactivity and specific activity of radiolabeled Herceptin with HER2 antigen were performed by HER2 positive NCI?N87 cell line and HER2 negative BGC823 cell line.Micro?PET imaging of BGC823 tumor?bearing nude mice revealed that tumor up?take of64Cu?NOTA?Herceptin got a gradual accumulation from 4 h to 60 h after intravenous injection of 7.4 MBq radiolabeled Herceptin.Uptake in the tumor was clearly visualized by emission computed tomography.64Cu?NOTA?Herceptin owns a great potential for molecular imaging of PET for diagnosis and follow?up of HER2 expression.

Herceptin；64Cu；Immunoreactivity；Molecular imaging；Tumor targeting therapy

O614；O628；O657.6

A

10.7503／cjcu20160593

2016?08?22.網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016?11?22.

國(guó)家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：81371592，81401467，81501519，81301323，81571705）和北京市自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：7154188，7162041）資助.

聯(lián)系人簡(jiǎn)介：楊 志，男，博士，研究員.主要從事放射性藥物研究.E?mail：pekyz＠163.com

沈 琳，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤研究.E?mail：linshenpku＠163.com