徐 彬，余元?jiǎng)?，王迎新，李建平，?萍，張 立

?

安徽省漢族人氨基糖苷類抗生素致耳聾患者基因突變的研究

徐 彬，余元?jiǎng)?，王迎新，李建平，?萍，張 立

目的 研究安徽省漢族人氨基糖苷類抗生素致耳聾(AAID)患者基因突變與其非綜合征性耳聾(NSHL)的關(guān)系，建立口腔黏膜細(xì)胞基因組DNA新一代基因測(cè)序法(NGS)。方法 由122例NSHL患兒及120 例健康兒童，取得口腔黏膜基因組DNA，應(yīng)用NGS對(duì)GJB2、12S rRNA 基因測(cè)序。結(jié)果 口腔黏膜細(xì)胞的基因組DNA質(zhì)量較好，能滿足NGS 研究需要；在122例NSHL患者中，28例GJB2 基因突變，占耳聾患者的22.95%；10例12S rRNA基因突變，占耳聾患者的8.20%。120例健康兒童中，未發(fā)現(xiàn)基因突變(P<0.01)。結(jié)論 口腔黏膜細(xì)胞基因組DNA 的NGS檢測(cè)法能用于檢出安徽省漢族人AAID基因突變；在安徽NSHL患者中GJB2、12S rRNA基因突變有其一定的特點(diǎn)，能對(duì)安徽省漢族人AAID基因突變研究提供幫助。

口腔黏膜細(xì)胞；耳聾；突變；GJB2；12S rRNA

我國(guó)每年約有3萬(wàn)例先天性耳聾發(fā)病患者[1]。50%耳聾與遺傳因素相關(guān)，為遺傳性耳聾，由遺傳因素、環(huán)境因素的共同作用而引發(fā)，包括非綜合征型耳聾[(non-syndromic hearing loss,NSHL)，約占70%]、綜合征型耳聾[(syndromic hearing loss,SHL)，約占30%]；已發(fā)現(xiàn)與NSHL相關(guān)的致病基因及其突變有一定異質(zhì)性，與人群的種族、地區(qū)不同相關(guān)[2]。氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides antibiotic,AmAn)使用中出現(xiàn)的聽(tīng)覺(jué)和前庭的損害常是不可逆的，可誘發(fā)氨基糖苷類抗生素致聾(aminoglycosides antibiotic induced deafness,AAID)[3-4]，與AAID相關(guān)的12S rRNA 基因突變，以C1494T、

spectral imaging of the brain:initial results of selecting optimal monochromatic image for beam-hardening artifacts and image noise reduction[J]. J Comput Assist Tomogr, 2011,35(2):294-7.

[5] 莫泳康，黃錦粧，馬樹(shù)華,等. 肝臟動(dòng)脈期CT能譜成像的影像優(yōu)選[J]. 國(guó)際放射醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(1):1-5.

[6] 王貴生,高建華,趙 帥,等.肝臟增強(qiáng)掃描門靜脈期能譜CT與傳統(tǒng)多層螺旋CT輻射劑量和圖像質(zhì)量的比較[J].中華放射學(xué)雜志, 2013,47(4):340-3.

A1555G、nt961insC、nt961delT、Tnt1095C等突變較常見(jiàn)[5]；研究[6]表明，GJB2基因上至少有110余種突變，可能與NSHL相關(guān)，GJB2基因突變的攜帶率為3%。目前遺傳性耳聾較常用的基因診斷方法包括基因芯片法、NGS法。該研究主要應(yīng)用口腔黏膜細(xì)胞的DNA，經(jīng)NGS法檢測(cè)耳聾致病基因突變, 以便為進(jìn)一步開(kāi)展AAID相關(guān)研究提供技術(shù)支持，為臨床合理治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 對(duì)象 安徽殘聯(lián)康復(fù)研究中心、安徽省優(yōu)生優(yōu)育遺傳醫(yī)學(xué)中心門診NSHL患者共122例，其中男童75例，女童47例；120例健康兒童作為對(duì)照，其中男童71例，女童49例。

1.1.2 病史采集 采用問(wèn)卷調(diào)查的方式, 由患者家屬等填寫。

1.1.3 純音聽(tīng)閾測(cè)定 應(yīng)用的全部?jī)x器按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)。① 耳科檢查：應(yīng)用耳鏡檢查外耳道、鼓膜；② 純音聽(tīng)閾測(cè)定：按照常規(guī)于靜室內(nèi)，采用丹麥Madsen502便攜式聽(tīng)力計(jì)，根據(jù)WHO預(yù)防聾和聽(tīng)力損失項(xiàng)目方法(1997年), 應(yīng)用上升法進(jìn)行氣導(dǎo)聽(tīng)閾測(cè)定，計(jì)算0.5、1、2、4kHz4個(gè)頻率聽(tīng)閾平均值為純音聽(tīng)閾；聽(tīng)力障礙者聽(tīng)力損失的具體分級(jí)如下：輕度聽(tīng)力損失：26～40dBHL；中度聽(tīng)力損失：41～60dBHL；重度聽(tīng)力損失：61～80dBHL；極重度聽(tīng)力損失：>81dBHL。

1.1.4 調(diào)查結(jié)果 122例患者均無(wú)親緣關(guān)系，經(jīng)體檢排除遺傳性SHL，否認(rèn)有中耳炎、接觸強(qiáng)噪音、外傷的病史, 耳科檢查鼓膜正常, 無(wú)穿孔、充血、內(nèi)陷；NSHL患者中，9例在3歲內(nèi)用過(guò)慶大霉素(7例)、鏈霉素(2例)，29例孕期或生后用藥情況不詳，84例無(wú)耳毒性藥物用藥史；77例為先天性聾(生后3個(gè)月內(nèi)確診)，41 例為生后6個(gè)月內(nèi)確診, 4例為1歲以后聽(tīng)力下降；耳聾程度分布情況見(jiàn)表1。

表1 不同發(fā)病時(shí)期耳聾程度分布情況(n)

1.2 基因組DNA抽提

1.2.1 口腔黏膜細(xì)胞 取122例遺傳性NSHL耳聾患者和120例健康人口腔黏膜細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，4 ℃保存；DNA抽提方法，按照本研究組已發(fā)表的文獻(xiàn)[7]制備基因組DNA溶液。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)時(shí)參考人類GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 遺傳性耳聾的序列, 并利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成，引物信息見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.3 PCR反應(yīng)體系和條件 反應(yīng)體系：Total 10 μl：polymerase 1 U；Primer forward (2 μmol/L)1 μl；Primer reverse (2 μmol/L)1 μl;DNA溶液1 μl; 10×buffer 1 μl;MgCl2(50 mmol/L)0.3 μl;dNTPs(10 mmol/L)0.2 μl；水補(bǔ)齊至10 μl。反應(yīng)條件：Preheat，95 ℃ 5 min；PCR 40 cycles(95 ℃ 15 s；60 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 15 min，4 ℃ 保存。

1.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 測(cè)序 PCR的反應(yīng)產(chǎn)物由華大生物科技公司檢驗(yàn)中心進(jìn)行熒光全自動(dòng)基因DNA正/反向測(cè)序，分析相關(guān)基因DNA突變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，耳聾組與健康對(duì)照組的基因DNA突變結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種DNA標(biāo)本來(lái)源的 DNA 基因檢測(cè)結(jié)果一致性分析用Kappa檢驗(yàn)，Kappa>0.75則兩者一致性較好。

1.6 突變分析 122例耳聾患者和120例健康人基因DNA的測(cè)序結(jié)果，與由GenBank中獲得的正常人相關(guān)基因DNA相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，分析突變情況。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 NSHL患者122例，其中男童75例(61.48%)，女童47例(38.52%)；男女之比為1.596 ∶1；均自愿參加，簽署知情通知書?；颊呔驮\年齡在出生后2～8(3.21±4.22)歲，男童平均年齡(4.26±5.12)歲，女童平均年齡為(3.61±3.96)歲；不同發(fā)病年齡耳聾程度分布不同。見(jiàn)表1。120例健康兒童作為對(duì)照，其中男童71例，女童49例；年齡在出生后2～8(3.39±4.37)歲，男童平均年齡(4.38±5.05)歲，女童平均年齡為(3.23±3.57) 歲。

2.2 提取DNA 取口腔頰黏膜細(xì)胞，制備基因組DNA溶液，凝膠電泳均為一條帶，達(dá)到檢驗(yàn)DNA溶液的純度；基因組DNA溶液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280均為1.8，純度合格；基因組DNA溶液濃度為1 μg/μl。

2.3 新一代基因測(cè)序分析結(jié)果 122例遺傳性耳聾患者及120 例健康對(duì)照人群口腔黏膜細(xì)胞的DNA的PCR擴(kuò)增、新一代基因測(cè)序分析后結(jié)果如下：在122例NSHL患者中，GJB2基因發(fā)現(xiàn)14例nt 235 del C雜合或純合突變，2例nt 235 del C+nt 299～300 del AT復(fù)合突變，1例nt 235 del C+nt 176 del 16復(fù)合突變，4例nt 299～300 del AT移碼突變，3例nt 176 del 16雜合突變, 2例nt 538 C→T純合突變, 2例nt 547 G→A純合突變，28例GJB2 基因突變患者占耳聾組的22.95%。

在122例NSHL患者中，線粒體12S rRNA基因發(fā)現(xiàn)3例nt 961 insC(如第12例)、3例nt 961 del T(如第23例)、1例nt 961 del T+T nt1095 C(如第28例)、2例A nt1555 G(如第63例)、1例C nt1494 T(如第86例)，10例線粒體12S rRNA基因突變患者占耳聾組的8.20%,結(jié)果顯示5種基因突變的相應(yīng)測(cè)序部分截圖見(jiàn)圖1～5。120 例健康對(duì)照者未發(fā)現(xiàn)基因突變, 與耳聾組基因突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.719,P<0.01)。

圖1 患者第12例基因突變測(cè)序部分截圖

男，4歲半，聽(tīng)力閾值90 dB,12S rRNA基因的961位點(diǎn)出現(xiàn)nt 961 insC的缺失，箭頭指示突變位置

圖2 患者第23例基因突變測(cè)序部分截圖

男，3歲10個(gè)月，聽(tīng)力閾值95 dB, 12S rRNA基因的961位點(diǎn)出現(xiàn)nt 961 delTC的插入，箭頭指示突變位置

圖3 患者第28例基因突變測(cè)序部分截圖

男，5歲，左耳聽(tīng)力閾值90 dB，右耳聽(tīng)力閾值95 dB, 12S rRNA基因的961位點(diǎn)出現(xiàn)nt 961 delT+T nt1095 C的復(fù)合突變，箭頭指示突變位置

3 討論

我國(guó)7歲以下的耳聾兒童約有80萬(wàn)例，常在應(yīng)用氨基糖苷類抗生素后出現(xiàn)聽(tīng)力損失，大部分為重度耳聾，少部分為輕中度耳聾，造成了嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題；利用準(zhǔn)確、低成本、高效率的耳聾基因診斷方法，早期發(fā)現(xiàn)、診斷耳聾發(fā)生的原因, 根據(jù)不同病因采取不同的干預(yù)措施，對(duì)耳聾兒童的生存質(zhì)量意義重大。

圖4 患者第63例基因突變測(cè)序部分截圖

女，4歲，聽(tīng)力閾值90 dB, 12S rRNA基因1555位點(diǎn)的A突變?yōu)镚，箭頭指示突變位置

圖5 患者第86例基因突變測(cè)序部分截圖

女，6歲，聽(tīng)力閾值95 dB,12S rRNA基因1494位點(diǎn)的C突變?yōu)門，箭頭指示突變位置

研究[8]顯示，由口腔黏膜細(xì)胞提取基因組DNA，可應(yīng)用于基因診斷。本研究結(jié)果表明，收集口腔黏膜細(xì)胞，抽取基因組DNA，可用于耳聾基因診斷，方法簡(jiǎn)易、方便。

GJB2基因常是非綜合征型耳聾的致病基因, 其中約50%為常染色體隱性遺傳性(DFNB)，約20%為常染色體顯性遺傳性(DFNA)；該基因位于DFNA3A基因座, 編碼縫隙連接蛋白Cx26，表達(dá)于內(nèi)耳上皮毛細(xì)胞等。GJB2基因突變后，突變Cx26可引發(fā)內(nèi)淋巴液鉀離子循環(huán)紊亂，能導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾，常表現(xiàn)為先天性、雙側(cè)對(duì)稱的、非進(jìn)行性重度耳聾；一般可見(jiàn)于新生兒聽(tīng)力篩查未通過(guò)的患兒，可被新生兒聽(tīng)力檢查 + 基因診斷聯(lián)合篩查發(fā)現(xiàn)。對(duì)中國(guó)2 063例耳聾患者進(jìn)行研究[9]表明GJB2基因突變?cè)贜SHL患者的陽(yáng)性率為14.9%，本研究結(jié)果陽(yáng)性率為22.95%，包括nt 235del C、235 del C+nt 299～300 del AT 、nt 235 del C+nt 176 del 16、nt 299～300 delAT、nt 176 del 16、nt 538 C→T、nt 547 G→A, 分別占122例患者的11.48%、1.64%、0.82%、3.28%、2.46%、1.64%、1.64%； 其陽(yáng)性率、分型情況與國(guó)內(nèi)報(bào)道一致；nt 235del C、nt 299～300 delAT、nt 176 del 16 可能是安徽省NSHL患者中的GJB2 基因突變熱點(diǎn)。

線粒體mtDNA 12S rRNA基因突變有母系遺傳的特點(diǎn)，與耳毒性藥物相關(guān)。研究[10]顯示mtDNA 無(wú)組蛋白而裸露，在12S rRNA發(fā)生Ant1555G、Cnt1494T突變后，能使12S rRNA 在空間結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌16S rRNA 相似，易結(jié)合AmAn，能引發(fā)氧化磷酸化紊亂，減少產(chǎn)生 ATP，可毒性損傷內(nèi)耳毛細(xì)胞，導(dǎo)致 AAID；后者對(duì) AmAn 敏感，有時(shí)可一針致聾。研究[11]證實(shí)mtDNA Ant1555G 點(diǎn)突變是 AAID 遺傳易感性的分子基礎(chǔ)，其在中國(guó)漢族人NSHL患者中的攜帶率存在地域、種族的差異, 其在南京、福州、武漢[12-14]的NSHL患者的檢出率分別為1.50%、0.67%、2.27%。本研究的檢出率為1.64%，其差異可能與各地區(qū)使用AmAn的頻率、基因突變檢測(cè)方法等相關(guān)。研究[12]提示mtDNA Cnt1494T點(diǎn)突變的致病機(jī)制與Ant1555G 類似。本研究對(duì)安徽省122例耳聾患者篩查，檢出1例Cnt1494T突變，檢出率為0.82%。

線粒體nt 961 del T/insC是12S rRNA的nt 961位T的缺失和(或)C插入；可能是AmAn致聾的又一重要原因[3]；該突變位于12S rRNA 基因的第21、22 環(huán)之間，可改變12S rRNA空間結(jié)構(gòu)，易與AmAn結(jié)合而引發(fā)中毒性耳聾。本研究在安徽省的122 例耳聾患者中檢出3例nt 961 insC、3例nt 961 del T、1 例復(fù)合突變nt 961 del T+Tnt 1095 C，總檢出率為5.74%，3種突變分別占122例耳聾患者的2.46%、2.46%、0.82%。T nt1095 C位于12S rRNA的第25螺旋，能導(dǎo)致線粒體mtDNA 空間結(jié)構(gòu)改變，促進(jìn)與AmAn的結(jié)合，引發(fā)氧化磷酸化紊亂，減少產(chǎn)生ATP，可毒性損傷內(nèi)耳毛細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生 AAID[15]。本研究顯示1例復(fù)合突變nt 961 del T+Tnt1095C，可能與耳聾發(fā)病相關(guān)；復(fù)合突變導(dǎo)致的耳聾癥狀可能較重，但需進(jìn)一步研究。本研究122例耳聾患者中，12S rRNA 基因的 Ant3243G、Ant7445G、Ant827G、Gnt7444A 等突變未檢出。

本研究提示AmAn誘發(fā)的藥物性耳聾在各年齡段均可出現(xiàn)，不能忽視線粒體基因突變的檢測(cè)，特別是有AmAn用藥史、母系家族遺傳史的患者；12S rRNA基因突變攜帶者發(fā)現(xiàn)后，要再檢查未耳聾的母系成員，可早期發(fā)現(xiàn)相同突變攜帶者，能對(duì)其進(jìn)行用藥指導(dǎo)，避免藥物性耳聾的發(fā)生。本研究建立的常見(jiàn)聾病基因分型快速檢測(cè)方法，能了解GJB2、12S rRNA等基因突變的情況，能提高基因突變檢出率, 可為本地區(qū)耳聾遺傳咨詢和聾病基因篩查提供依據(jù)。

[1] Xin F,Yuan Y,Deng X.Genetic mutations in nonsyndromic deafness patients of Chinese minority and han ethnicities in Yunnan, China[J].J Transl Med,2013,11:312-21.

[2] 朱一鳴，郭玉芬，劉曉雯，等.陜西省部分聾啞學(xué)生聾病易感基因分子流行病學(xué)研究[J].聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志,2010,18(3)：225-8.

[3] 管敏鑫, 趙立東.與氨基糖苷類抗生素耳毒性相關(guān)的線粒體12S rRNA突變的流行病學(xué)特征[J].中華耳科學(xué)雜志,2006,4(2):98 -105.

[4] 曹 云，馮大飛，張 磊. 線粒體MT-RNR1基因突變與藥物性聾[J].聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志,2013,21(4):428-30.

[5] Mahmoud R F,Lubna M D,Samir A,et al.Screening for the mitochondrialA1555G mutation among Egyptian patients with non-syndromic, sensorineural hearing loss[J]. Int J Mol Epidemiol Genet,2014,5(4):200-4.

[6] Wei Q,Liu Y,Wang S,et al.A novel compound heterozygous mutation in the GJB2 gene causing non-syndromic hearing loss in a family[J].Int J Mol Med,2014,33(2):310-6.

[7] 徐 彬，余元?jiǎng)祝U遠(yuǎn)程，等.肝豆?fàn)詈俗冃灾蠥TP7B基因復(fù)合突變的研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(11)：1209-14.

[8] 程家蓉，關(guān)賽芳，王學(xué)勵(lì)，等.從人口腔細(xì)胞獲取基因組DNA作基因多態(tài)性分析的可行性[J]. 癌癥，2005，24(7)：893-7.

[9] Dai P, Yu F, Han B, et al. GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment[J].J Transl Med,2009,7:26.

[10]Guan M X. Prevalence of mitochondrial 12S rRNA mutations associated with aminoglycoside ototoxicity[J]. Mitochondrion, 2011,11(2):237-45.

[11]趙 芳，張芩娜.一母系遺傳氨基糖苷類抗生素致聾家系線粒體DNA A1555G 突變檢測(cè)[J].中華耳科學(xué)雜志,2010,8(1)：40-5.

[12]戴大春，魯雅潔，陳智斌，等.非綜合征耳聾患者線粒體DNA12S rRNA及tRNAser(UCN) 基因序列分析[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(1)：67-71.

[13]鄧 蔚，于 飛，戴 樸，等. 福州市特教學(xué)校非綜合征性聾分子病因?qū)W分析-GJB2 235delC突變和線粒體DNA 12S rRNA A1555G突變篩查報(bào)告[J].中華耳科學(xué)雜志, 2006，4(1)：12-4.

[14]何 勇, 孫 勍, 戴 樸，等. 武漢地區(qū)非綜合征性聾分子病因?qū)W分析-GJB2 235delC突變和線粒體DNA 12S rRNA A1555G突變篩查報(bào)告[J].中華耳科學(xué)雜志, 2006,4(1)：24-6.

[15]Zhao L,Young W Y, Li R, et al.Clinical evaluation and sequence analysisof the complete mitochondrial genome of three Chinese patients with hearing impairment associated with the 12S rRNA 1095 T>C mutation[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,325(4):1503-8.

AbstractObjectiveTostudytherelationshipofthegenemutationsofAnhuiHanpeopleaminoglycosidesantibioticsinduceddeafness(AAID)patientsandnon-syndromichearingloss(NSHL),andsetupnext-generationsequencing(NGS)oforalmucosalcellsgenomaDNA.MethodsFrom122casesofNSHLpatientsand120casesofhealthychildren,wegottheoralmucosalcellsgenomaDNAsandusingNGSsequencedGJB2,12SrRNAgenes.ResultsThegenomaDNAsoforalmucosalcellsweregoodqualityforNGSstudy.In122casesofNSHLpatients,wefoundGJB2genemutationsof28casea(22.95%),andfound12SrRNAgenemutationsof10casea(8.20%).In120casesofhealthychildren,wedidnotfindanymutation(P<0.01).ConclusionNGSsequencingmethodoforalmucosalcellsgenomaDNAcanbeusedfordetectingthemutationsofAnhuiHanpeopleAAID.ThemutationsofGJB2,12SrRNAgenesinAnhuiNSHLpatientshavesomedifferentcharictersandcanhelptostudythegenemutationsofAnhuiHanpeopleAAID.

Keywordsoralmucosalcell；deafness；mutation；GJB2；12SrRNA

Comparative study of abdominal imaging quality between mixed energy mode and mono-energy mode reconstruction on dual-energy spectral CT

Wei Wei, Deng Kexue, Zhao Yingming, et al

(DeptofRadiology,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001)

ObjectiveToevaluatethedifferenceofmixedenergymodeandmono-energymodereconstructionimagesonabdomenspectralCTimaging.MethodsAbdomenpre-contrastandcontrastenhancedCTscanswereappliedwithspectralCTonsixtypatients.Imageswerereconstructedbytwo-modes:QCmodeandMonomode.Thefollowingvariableswerecompared:signal-to-noise(SNR)ofliver,spleenandpancreas,contrast-to-noise(CNR)ofliver,spleenandpancreas.Twoexperiencedradiologistsevaluatedtheartifactlevelofimagesofthetworeconstructionmodes.ResultsComparedwithmixed-energymodeimages,70keVmono-energyimagesyieldedsignificantlygreaterSNRandCNR(P<0.05).Subjectivescoreof70keVmono-energyimageswashigherthanthatofmixed-energyimage(P<0.001).ConclusionInabdominalspectralCTimaging,mono-energyreconstructioncanprovidehigherqualityofimagesthanmixed-energyreconstructionandcanreplacemixed-energyimagesinclinicaldiagnosis.

abdomen;computedtomography;X-raycomputed;spectralCT;reconstructionmode

Research of genetic mutation in Anhui Han people AAID patients

Xu Bin,Yu Yuanxun,Wang Yingxin,et al

(AnhuiMedicalGeneticsCenterinAnhuiMedicalCollege,Hefei230061)

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2014A128)

安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校省遺傳醫(yī)學(xué)中心，合肥 230061

徐 彬，男，副研究員，責(zé)任作者，E-mail：xb.1030@163.com

時(shí)間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.022.html

R 969.3

A

1000-1492(2016)11-1653-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.023

2016-06-22接收