鄧碧凡，廖 敏，邱榮敏，高 波，張?jiān)乒穑R 燕，龍劍文

?

重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響

鄧碧凡1，廖 敏1，邱榮敏1，高 波1，張?jiān)乒?，馬 燕1，龍劍文2

目的 研究重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法 采用MTT法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)細(xì)胞增殖的影響，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)低氧條件下重樓皂苷Ⅰ對(duì)Hep-2細(xì)胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達(dá)的影響。采用Western blot法檢測(cè)低氧條件下，重樓皂苷Ⅰ對(duì)Hep-2細(xì)胞VEGF、HIF-1α、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT-3), 磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT-3)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖有抑制作用；其中，1.5、3、6 μg/ml濃度組重樓皂苷Ⅰ可下調(diào)低氧Hep-2細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)。同時(shí)，重樓皂苷Ⅰ抑制了STAT-3、p-STAT-3的表達(dá)。結(jié)論 重樓皂苷Ⅰ能抑制低氧條件下喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和HIF-1α、VEGF的表達(dá)，可能與其下調(diào)STAT-3表達(dá)及抑制STAT-3的磷酸化有關(guān)。

重樓皂苷Ⅰ;Hep-2細(xì)胞;細(xì)胞增殖;HIF-1α; VEGF

喉鱗狀細(xì)胞癌為常見(jiàn)頭頸部惡性腫瘤，我國(guó)喉癌發(fā)病率約占頭頸部腫瘤的13.9%，為全身惡性腫瘤的2.1%[1]。雖然近來(lái)喉癌治療方式已有很大提高，但喉癌患者總的生存率仍然很低。喉癌的綜合治療已成為一種治療趨勢(shì)。尋找高效、低毒的抗喉癌藥物十分重要。低氧是實(shí)體惡性腫瘤增殖中一種常見(jiàn)現(xiàn)象[2]，缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia inducible factor 1-α，HIF-1α) 是喉癌腫瘤低氧中的中樞環(huán)節(jié)，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是促血管生成因子，目前是抑制腫瘤血管生成的主要靶點(diǎn)[4]。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription3, STAT-3)參與腫瘤細(xì)胞的增殖，并可以調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF的表達(dá)[5]。重樓是中醫(yī)治療腫瘤的常用藥物之一，目前研究[6]表明，重樓有效成分重樓皂苷Ⅰ對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但對(duì)喉癌腫瘤細(xì)胞作用如何，目前暫無(wú)報(bào)道。該研究觀察重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下喉癌Hep-2細(xì)胞增殖活性的影響，以及對(duì)低氧Hep-2細(xì)胞HIF-1α、VEGF和STAT-3表達(dá)的影響，探討重樓皂苷Ⅰ治療喉癌的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重樓皂苷Ⅰ 粉劑(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；Hep-2喉癌細(xì)胞株[中國(guó)科學(xué)院(上海)]；100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素和MTT試劑盒(武漢博士德生物公司)；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清和胰蛋白酶(美國(guó) Gibco公司)；TRIzol總RNA提取試劑(美國(guó) Invitrogen公司)；Quantonestep RT-PCR試劑盒、SYBR green熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(北京天根生化公司)；多克隆兔抗VEGF、多克隆兔抗STAT3、多克隆兔抗HIF-1α、多克隆兔抗p-STAT3、β-actin試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)；辣根酶標(biāo)記抗兔lgG抗體(英國(guó) Abcam公司)；辣根酶標(biāo)記的β-actin抗體(上海興悠生物科技有限公司)；ECL試劑盒(瑞典 Amersham Biosciences公司)。分光光度儀(芬蘭 Multiskan MS公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo Electron公司)

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Hep-2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2空氣，含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，在細(xì)胞聚集達(dá)60%～70%時(shí)，置于37 ℃，含1%O2、5%CO2、94%N2的低氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，提取細(xì)胞總RNA及總蛋白。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將Hep-2細(xì)胞接種于96孔板(5×104個(gè)/孔)，細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合狀態(tài)時(shí)，加入重樓皂苷Ⅰ，各組終濃度分別為0、0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示以上濃度對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒作用)，每組6個(gè)平行孔，低氧培養(yǎng)36 h，加入20 μl 5 mg/ml MTT，培養(yǎng)4 h，再加入DMSO振蕩，調(diào)零，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組的光密度(optical density, OD)值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)=1-OD1/OD2，OD1表示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值，OD2表示空白對(duì)照組OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 測(cè)定低氧條件下重樓皂苷Ⅰ對(duì)HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達(dá)的影響 Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)同1.3。設(shè)計(jì)相關(guān)基因上、下游引物，HIF-1α上游引物：5′-CAACCGGTTTAAGGACACATTCTG-3′,下游引物：5′-TCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度150 bp；VEGF上游引物：5′-AAGTGGTCCCAGGCTGCA-3′，下游引物：5′-CTCCAGGCCCTCGTCA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為216 bp；GAPDH上游引物：5′-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3′,下游引物：5′-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為141 bp。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；取cDNA 1 μl，加入2.5×RealMasterMix/20×SYBR Solution 11.25 μl，上下游引物各為1 μl，加無(wú)Rnase水，反應(yīng)體積共25 μl；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，循環(huán)條件為95 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸50 s。采用ΔCt值法計(jì)算結(jié)果，ΔCt=樣品的Ct均值-內(nèi)參的Ct均值，2-ΔΔCt即為初始cDNA的相對(duì)含量。

1.5 Western blot法檢測(cè) Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)同1.3，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法蛋白定量，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉l h；PBS洗膜，加一抗(兔抗VEGF 1 ∶500、兔抗STAT3 1 ∶500、兔抗HIF-1α 1 ∶500、兔抗p-STAT3 1 ∶400)，4 ℃過(guò)夜；PBS洗膜；加入二抗(辣根酶標(biāo)記抗兔IgG抗體1 ∶3 000)孵育0.5 h，洗膜，采用ECL試劑盒檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)活性 低氧條件下培養(yǎng)36 h后，重樓皂苷Ⅰ 6 μg/ml組(t=35.22，P<0.01)、3 μg/ml組(t=21.14，P<0.01)、1.5 μg/ml組(t=9.33，P<0.01)與空白對(duì)照組抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3 μg/ml組(t=12.06，P<0.01)、1.5 μg/ml組(t=23.89，P<0.01)與6 μg/ml組抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，其作用具有濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞增殖作用的影響 ×400

A：空白對(duì)照組；B～E：重樓皂苷Ⅰ 0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml組；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01

2.2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較, 6 μg/ml組(t=14.89,P<0.01)、3 μg/ml組(t=10.65,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=7.11,P<0.01)重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)均有抑制作用。與空白對(duì)照組比較，6 μg/ml組(t=17.21,P<0.01)、3 μg/ml組(t=12.84,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=7.83,P<0.01)重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)均有抑制作用。見(jiàn)圖2。

2.3 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞HIF-1α、VEGF、p-STAT3、STAT3表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較, 6 μg/ml組(t=23.97,P<0.01)、3 μg/ml組(t=14.04,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=9.51,P<0.01) 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)有明顯抑制作用。與空白對(duì)照組比較, 6 μg/ml組(t=8.36,P<0.01)和3 μg/ml組(t=4.33,P<0.01)重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)有明顯抑制作用。與空白對(duì)照組比較, 6 μg/ml組(t=23.03,P<0.01)、3 μg/ml組(t=18.58,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=13.21,P<0.01) 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)有抑制作用。與空白對(duì)照組比較, 6 μg/ml組(t=22.56,P<0.01)、3 μg/ml組(t=13.00,P<0.01)和1.5 μg/ml組(t=9.09,P<0.01) 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧Hep-2細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)有抑制作用。見(jiàn)圖3。

圖2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞HIF-1α mRNA、VEGF mRNA表達(dá)的影響

A：空白對(duì)照組；B～E：重樓皂苷Ⅰ 0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml組；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01

3 討論

由于喉癌腫瘤組織生長(zhǎng)過(guò)快，腫瘤細(xì)胞往往存在低氧情況。研究[7]顯示，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，Hep-2細(xì)胞計(jì)數(shù)會(huì)逐漸增高。這說(shuō)明一定程度的低氧會(huì)促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖。經(jīng)過(guò)重樓皂苷Ⅰ處理后，抑制了低氧誘導(dǎo)的Hep-2細(xì)胞的增殖，提示重樓皂苷Ⅰ具有抑制喉癌腫瘤細(xì)胞增殖的活性。以往研究[6]表明重樓皂苷Ⅰ對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)耐藥性肝癌細(xì)胞的凋亡。但在喉癌Hep-2細(xì)胞中，重樓皂苷Ⅰ是通過(guò)何種途徑發(fā)揮抑制作用還需要進(jìn)一步研究。

圖3 重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧條件下Hep-2細(xì)胞HIF-1α、VEGF、 p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)的影響

A：空白對(duì)照組；B～D：重樓皂苷Ⅰ 1.5、3.0、6.0 μg/ml組；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01

研究[8]表明HIF-1α在細(xì)胞低氧中發(fā)揮重要作用，HIF-1是一種由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體。在正常情況下，HIF-1α通過(guò)羥基化而降解，低氧條件下，HIF-1α羥基化降解被抑制，與HIF-1β組成異源二聚體，轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[8]。靶基因包括VEGF、促紅細(xì)胞生成素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、內(nèi)皮素1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和胰島素樣生長(zhǎng)因子等[9]，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，能夠介導(dǎo)新生血管的形成，在喉癌的生長(zhǎng)、侵襲中發(fā)揮重要作用[10]。且與喉癌的分化程度、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)[11]。研究[12]表明重樓皂苷Ⅰ能夠抑制低氧情況下Lewis腫瘤細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)。本研究也表明重樓皂苷Ⅰ對(duì)低氧Hep-2細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)均有抑制作用。

在腫瘤中，各種蛋白激酶的活化已被證實(shí)，雖然不同的激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同，但STAT3在多數(shù)信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[13]，STAT3蛋白通過(guò)上調(diào)細(xì)胞凋亡抑制基因(如MCL1等)的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(如MYC等)的表達(dá)，參與和促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[14]。STAT3的活化是許多惡性腫瘤的重要特征[15]。先前的一些研究[5]表明，STAT3對(duì)于HIF-1α表達(dá)是非常重要的，STAT3抑制劑能下調(diào)HIF-1α表達(dá)。STAT3也可通過(guò)誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生參與腫瘤進(jìn)展[16]。STAT3抑制劑能有效抑制VEGF生產(chǎn)與腫瘤血管的形成[5]。 Zhang et al[17]發(fā)現(xiàn)STAT3抑制劑AG490能明顯抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果表明重樓皂苷Ⅰ能夠下調(diào)低氧狀態(tài)下喉癌Hep-2細(xì)胞STAT3的表達(dá)，并抑制STAT3的磷酸化。這可能是重樓皂苷Ⅰ抑制低氧喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和HIF-1α、VEGF表達(dá)的原因之一。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ能夠抑制低氧喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和HIF-1α、VEGF表達(dá)，這可能與其下調(diào)Hep-2細(xì)胞STAT3的表達(dá)，并抑制STAT3的磷酸化有關(guān)。

[1] 孔維佳.耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)[M].2版.人民衛(wèi)生出版社，2010:460.

[2] Weljie A M, Jirik F R. Hypoxia induced metabolic shifts in cancer cells: moving beyond the Warburg effect[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011, 43(7):981-9.

[3] Yu L,Liu Y,Cui Y. Expression of hypoxia inducible factor-1alpha and its relationship to apoptosis and proliferation in human laryngeal squamous cell carcinoma[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2004, 24(6):636-8.

[4] Grunstein J, Roberts W G, Mathieu-Costello O, et al. Tumor-derived expression of vascular endothelial growth factor is a critical factor in tumor expansion and vascular function[J]. Cancer Res,1999, 59(7): 1592-8.

[5] Xu Q, Briggs J, Park S, et al. Targeting Stat3 blocks both HIF-1 and VEGF expression induced by multiple oncogenic growth signaling pathways[J]. Oncogene,2005,24(36):5552-60.

[6] Cheung J Y, Ong R C, Suen Y K, et al. Polyphyllin D is a potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells[J]. Cancer Lett, 2005, 217(2):203-11.

[7] Xu O, Li X M, Qu Y T, et al. Regulation of glucose transporter protein-1 and vascular endothelial growth factor by hypoxia inducible factor 1α under hypoxic conditions in Hep-2 human cells[J]. Mol Med Rep,2012,6(6):1418-22.

[8] Wang G L, Jiang B H, Rue E A, et al. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension[J]. Proc Natl Acad Sci,1995,92(12):5510-4.

[9] Elson D A, Ryan H E, Snow J W, et al. Coordinate up-regulation of hypoxia inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-1 target genes during multi-stage epidermal carcinogenesis and wound healing[J]. Cancer Res,2000,60(21):6189-95.

[10]Bonhin R G,Rocha V B,de Carvalho G M, et al. Correlation between vascular endothelial growth factor expression and presence of lymph node metastasis in advanced squamous cell carcinoma of the larynx[J]. Braz J Otorhinolaryngol,2015,81(1):58-62.

[11]瞿 帥,宋 楊,梅金玉,等. IL-17及其受體調(diào)控JAK/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)喉癌血管生成的作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,50(10):1464-7.

[12]Ma D D, Lu H X, Xu L S,et al. Polyphyllin D exerts potent anti-tumoureffects on Lewis cancer cells under hypoxic conditions[J]. J Int Med Res,2009,37(3):631-40.

[13]Bowman T, Garcia R, Turkson J, et al. STATs in oncogenesis[J]. Oncogene, 2000,19(21):2474-88.

[14]Darnell J E Jr. STATs and gene regulation[J].Science,1997,277(5332):1630-5.

[15]Catlett-Falcone R, Dalton W S,et al. STAT proteins as novel targets for cancer therapy. Signal transducer an activator of transcription[J]. Curr Opin Oncol,1999,11(6):490-6.

[16]Niu G, Wright K L, Huang M, et al. Constitutive Stat3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis[J]. Oncogene,2002,21(13):2000-8.

[17]Zhang H,Zhang D,Luan X, et al. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription(STAT) 3 signaling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells[J]. J Int Med Res,2010,38(5):1673-81.

Effect of Polyphylin I on proliferation and expressions of HIF-1α，VEGF in laryngeal carcinoma cell line Hep-2 under hypoxia

Deng Bifan, Liao Min, Qiu Rongmin, et al

(DeptofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,HezhouPeople′sHospital,Hezhou542899)

ObjectiveToinvestigatetheeffectsofPolyphyllinIonproliferationandexpressionsofHIF-1α,VEGFinlaryngealcarcinomacelllineHep-2underhypoxia.MethodsMTTassaywasperformedtoinvestigatetheeffectofPolyphyllinIontheproliferationofHep-2cellsunderhypoxicconditions.Real-timequantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionwasusedtodetecttheeffectofPolyphyllinIontheexpressionsofHIF-1αmRNAandVEGFmRNA.WesternblotwasusedtodetecttheeffectofPolyphyllinIontheexpressionsofVEGF,HIF-1α,STAT-3andp-STAT-3.ResultsPolyphyllinIinhibitedHep-2cellsproliferationunderhypoxiacondi-tion.PolyphyllinItreatment(1.5，3，6μg/ml)down-regulatedthemRNAandproteinexpressionsofHIF-1α,VEGFinHep-2cellsunderhypoxia.Meanwhile,PolyphyllinItreatmentinhibitedtheproteinexpressionsofSTAT-3andp-STAT-3inHep-2cellsunderhypoxia.ConclusionPolyphyllinIinhibitsHep-2cellsproliferationanddown-regulatestheexpressionsofHIF-1αandVEGFinHep-2cellsunderhypoxia.ItmayberelatedtoreducedSTAT-3expressionandinhibitionofthephosphorylationofSTAT-3inHep-2cellsunderhypoxia.

PolyphyllinI;Hep-2cell;cellproliferation;HIF-1α;VEGF

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研指導(dǎo)性項(xiàng)目(編號(hào)：2013Z-B05)

1賀州市人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，賀州 5428992湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，武漢 430061

鄧碧凡，男，碩士，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail:ljwhbzyy@qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.013.html

R 767.1

A

1000-1492(2016)11-1613-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.013

2016-06-15接收