范 潔，張 磊，王 嘯

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人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

范 潔1,2,3，張 磊1,2，王 嘯4

目的 研究人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡影響。方法 體內(nèi)實驗采用HepG2細(xì)胞裸鼠腋部皮下接種，制備荷瘤鼠肝癌模型，分為生理鹽水組、人參皂苷Rk3 (25、50、100 mg/kg)組和5-氟尿嘧啶(5-Fu，20 mg/kg)組；體外實驗分為正常組、人參皂苷Rk3 (20、40、80 μmol/L)組和5-Fu(50 μg/ml)組；MTT法檢測HepG2細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞凋亡；RT-PCR法檢測HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2，cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA表達(dá)；Western blot法檢測HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5蛋白表達(dá)。結(jié)果 人參皂苷Rk3(100 mg/kg)夠明顯抑制瘤體重量(P<0.05)；人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L )能明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡；人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)能顯著增加Bax、cleved-Caspase-3、DR4和DR5蛋白和mRNA的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 人參皂苷Rk3可能通過DR4、DR5誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

人參皂苷Rk3；HepG2；凋亡

肝癌的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷了肝炎-肝硬化-肝癌三個病變過程，是一個多步驟、多階段的病理學(xué)過程[1-2]。肝癌因其惡性程度高、進(jìn)展迅速以及治療復(fù)雜造成的療效預(yù)后差[3]一直是臨床研究的熱點。目前治療肝癌最有效的方法是手術(shù)切除或肝移植，但是多數(shù)患者并不具備手術(shù)指征和條件，術(shù)后發(fā)病率高也導(dǎo)致治療困難。研究[4-5]表明，通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡能夠有效控制腫瘤，因此，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是抗肝癌藥物研究的重要思路之一。人參皂苷Rk3是人參在蒸制成紅參過程中生成的一種重要的稀有人參皂苷，研究[6]表明，紅參提取物能明顯抑制DMBA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖，延長荷瘤小鼠的存活時間。近年來，關(guān)于人參皂苷抗腫瘤活性的研究取得了重大進(jìn)展，體內(nèi)外抗腫瘤研究[7-10]表明，具有腫瘤細(xì)胞毒性作用的人參皂苷多為一些稀有皂苷，研究較多的是稀有人參皂苷Rg3、Rh2、Rh1以及苷元原人參二醇和原人參三醇，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、促使腫瘤細(xì)胞分化、提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性以及提高機(jī)體抗腫瘤免疫力方面均有顯著作用。然而，稀有人參皂苷Rk3的抗腫瘤藥理活性尚未見報道。該研究通過體內(nèi)體外實驗探討人參皂苷Rk3對肝癌的作用。體內(nèi)采用裸鼠建立肝癌模型，觀察人參皂苷Rk3對腫瘤大小的影響；體外觀察其對HepG2細(xì)胞株凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和動物 人肝癌細(xì)胞株(HepG2)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；清潔級Balb/c裸鼠，16～20 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑 人參皂苷Rk3購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，有效成分≥98%；5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 5-Fu)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，有效成分=99%；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；TRIzol購自美國Sigma公司；Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Ferments公司；小鼠抗β-actin抗體購自美國 Santa Cruze公司；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5抗體購自武漢博士德公司；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4、DR5引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 MK3型酶標(biāo)儀(荷蘭雷勃公司)；SW-CJ-IF型超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(德國Eppedorf公司)；Bio-rad電泳儀(美國伯樂公司)；COULTZER EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%密度時進(jìn)行傳代。

1.2.2 HepG2荷瘤鼠肝癌模型的建立 取對數(shù)期細(xì)胞1×107～5×107/ml 200 μl接種于裸鼠右腋部皮下。第4周給予人參皂苷Rk3(25、50、100 mg/kg)和5-Fu(20 mg/kg)灌胃，生理鹽水組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃4周；8周后處死裸鼠取出瘤體，測量瘤體重量。

1.2.3 細(xì)胞增殖試驗 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×108/ml的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔約100 μl，37 ℃過夜。待細(xì)胞完全貼壁后加入人參皂苷Rk3(0、5、10、20、40、80 μmol/L)，分別作用6、12、24、48 h后，棄去培養(yǎng)基，換無血清培養(yǎng)液，然后每孔加MTT(5 mg/ml) 20 μl，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液并每孔加150 μl DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，室溫振蕩溶解10 min后，于492 nm波長處測吸光度(absorbance，A)值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取不同濃度的人參皂苷處理后的HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后；1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次；用400 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μl Annexin V染液，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μl PI后輕輕混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育5 min；上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5的蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，加入400 μl含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后；4 ℃、12 000 r/min離心30 min；取上清液加入SDS上樣緩沖液，99.9 ℃變性10 min。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫5%脫脂牛奶孵育3 h后；一抗孵育過夜后，二抗孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.2.6 RT-PCR法檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5的mRNA表達(dá) 使用TRIzol法提取HepG2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃變性40 s，51～58 ℃ 復(fù)性40 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)。引物序列見表1。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測光密度。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rk3對HepG2荷瘤鼠瘤體重量的影響 與生理鹽水組比較，人參皂苷Rk3(100 mg/kg)能夠明顯降低腫瘤的重量(F=56.6,P<0.05)。 見表2。

表1 引物序列

表2 人參皂苷Rk3對HepG2荷瘤鼠瘤體重量的影響

2.2 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞增殖的影響 與未加人參皂苷Rk3比較，人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)在24、48、72 h能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖(F=38.4、48.5、69.7，P<0.05)。人參皂苷Rk3隨著藥物作用時間延長和濃度增加抑制HepG2細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。見圖1。

2.3 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V和PI雙標(biāo)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示，與正常組(3±0.32)%比較，人參皂苷Rk3 20 μmol/L組(13±1.31)%、40 μmol/L組(17±1.92)%和80 μmol/L組(25±2.92)%能夠明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 見圖2。

圖1 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖2 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

2.4 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果見圖3、4，給予不同濃度的人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)后，Bax、cleved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA和蛋白明顯增加(P<0.05)；Bcl-2的mRNA和蛋白顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

人參皂苷 Rk3是從人參炮制品紅參藥材中分離提純的一種單體，為四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷。

圖3 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA表達(dá)的影響

M：Marker；A～D:人參皂苷Rk3 0、20、40、80 μmol/L; E: 5-Fu 50 μg/ml；與人參皂苷Rk3 0 μmol/L比較：**P<0.01

Quan et al[11]通過體外實驗證明，稀有人參皂苷Rk3對胰腺癌、白血病、結(jié)腸癌等細(xì)胞株的增殖有明顯抑制作用。

本研究顯示，人參皂苷Rk3能夠顯著抑制HepG2荷瘤鼠肝癌模型中腫瘤的重量。同時， MTT結(jié)果顯示人參皂苷Rk3 (20、40、80 μmol/L)在24、48、72 h能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖，并隨著藥物作用時間延長和濃度增加抑制HepG2細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。為了觀察人參皂苷Rk3對HepG2凋亡的影響，本研究使用Annexin V和PI雙標(biāo)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)能夠增加HepG2細(xì)胞凋亡，同時cleaved-Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高。

死亡受體分子DR4和DR5與TRAIL結(jié)合后，通過招募Caspase-8傳遞死亡信號，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。本研究顯示給予人參皂苷Rk3后，DR4和DR5的表達(dá)明顯增加，提示人參皂苷Rk3能夠誘導(dǎo)HepG2的凋亡可能與DR4和DR5有關(guān)。Bcl-2是一種原癌基因，能夠增強(qiáng)細(xì)胞對大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性，抑制細(xì)胞的凋亡，而其同源的Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。Bax的過表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明人參皂苷Rk3能夠降低Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，增加Bax的表達(dá)。上述結(jié)果提示，人參皂苷Rk3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡可能是通過上調(diào)DR4、DR5及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

圖4 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 蛋白表達(dá)的影響

A～D:人參皂苷Rk3 0、20、40、80 μmol/L; E: 5-Fu 50 μg/ml; 與人參皂苷Rk3 0 μmol/L比較：*P<0.05，**P<0.01

綜上所述，本研究結(jié)果證實人參皂苷Rk3對荷瘤鼠肝癌有一定的抑制作用，并可能通過影響DR4、DR5和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of ginsenoside Rk3 on apoptosis of HepG2

Fan Jie1,2,3, Zhang Lei1,2, Wang Xiao4

(1SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032;2AnhuiProvincialKeyLaboratoryofNatureMedicines,Hefei230032;3PharmaceuticalPreparationSection,TonglingPeople’sHospital,Tongling244000;4DeptofRadiology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

ObjectiveTostudytheeffectofginsenosideRk3onapoptosisofHepG2.MethodsTumorbearingmice model of liver cancer was prepared inoculating HepG2 cells in axilla of nude mice subcutaneously. The nude mice were grouped into saline group, ginsenoside Rk3 (25, 50 ,100 mg/kg) group and 5-Fu (20 mg/kg) groupinvivo. And the HepG2 cells were divided into normal group, ginsenoside Rk3(20, 40, 80 μmol/L) group and 5-Fu(50 μg/ml) groupinvitro. The inhibition rate of HepG2 cells was evaluated by MTT assay. The apoptosis distribution of HepG2 cells was detected by flow cytomtric analysis. The mRNA expressions of Bax, Bcl-2, cleaved- Caspase-3, DR4 and DR5 in HepG2 cells were detected by RT-PCR. The protein expressions of Bax, Bcl-2 cleaved-Caspase-3, DR4 and protein in HepG2 cells were observed by Western blot.ResultsGinsenoside Rk3(100 mg/kg) significantly inhibited tumor weight(P<0.05). Ginsenoside Rk3(20, 40 and 80 μmol/L) significantly inhibited the proliferation and induced apoptosis in HepG2 cells. Ginsenoside Rk3(20, 40 and 80 μmol/L) significantly increased Bax, cleaved-Caspase-3 DR4 expression and DR5 mRNA and protein, reduced the expression of Bcl-2 mRNA and protein. The difference was statistically significant.ConclusionGinsenoside Rk3 can induce apoptosis of HepG2 cells possibly through the DR4 and DR5.

ginsenoside Rk3; HepG2; apoptosis

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(編號：81100302)；安徽高校省級自然科學(xué)研究重點項目(編號：KJ2014A124)

1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 2300322安徽省天然藥物活性成分研究重點實驗室，合肥 2300323銅陵市人民醫(yī)院藥劑科，銅陵 2440004安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，合肥 230022

范 潔，女，主管藥師，碩士研究生； 張 磊，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhangl@ahmu.edu.cn； 王 嘯，男，博士，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：hfwangxiao@aliyun.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.011.html

R -332; R 735.7

A

1000-1492(2016)11-1604-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.011

2016-06-10接收