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        人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

        2016-12-14 06:32:26潔,張磊,王
        關(guān)鍵詞:荷瘤皂苷人參

        范 潔,張 磊,王 嘯

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        人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

        范 潔1,2,3,張 磊1,2,王 嘯4

        目的 研究人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡影響。方法 體內(nèi)實驗采用HepG2細(xì)胞裸鼠腋部皮下接種,制備荷瘤鼠肝癌模型,分為生理鹽水組、人參皂苷Rk3 (25、50、100 mg/kg)組和5-氟尿嘧啶(5-Fu,20 mg/kg)組;體外實驗分為正常組、人參皂苷Rk3 (20、40、80 μmol/L)組和5-Fu(50 μg/ml)組;MTT法檢測HepG2細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞凋亡;RT-PCR法檢測HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2,cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA表達(dá);Western blot法檢測HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5蛋白表達(dá)。結(jié)果 人參皂苷Rk3(100 mg/kg)夠明顯抑制瘤體重量(P<0.05);人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L )能明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡;人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)能顯著增加Bax、cleved-Caspase-3、DR4和DR5蛋白和mRNA的表達(dá),降低Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 人參皂苷Rk3可能通過DR4、DR5誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

        人參皂苷Rk3;HepG2;凋亡

        肝癌的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷了肝炎-肝硬化-肝癌三個病變過程,是一個多步驟、多階段的病理學(xué)過程[1-2]。肝癌因其惡性程度高、進(jìn)展迅速以及治療復(fù)雜造成的療效預(yù)后差[3]一直是臨床研究的熱點。目前治療肝癌最有效的方法是手術(shù)切除或肝移植,但是多數(shù)患者并不具備手術(shù)指征和條件,術(shù)后發(fā)病率高也導(dǎo)致治療困難。研究[4-5]表明,通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡能夠有效控制腫瘤,因此,誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是抗肝癌藥物研究的重要思路之一。人參皂苷Rk3是人參在蒸制成紅參過程中生成的一種重要的稀有人參皂苷,研究[6]表明,紅參提取物能明顯抑制DMBA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖,延長荷瘤小鼠的存活時間。近年來,關(guān)于人參皂苷抗腫瘤活性的研究取得了重大進(jìn)展,體內(nèi)外抗腫瘤研究[7-10]表明,具有腫瘤細(xì)胞毒性作用的人參皂苷多為一些稀有皂苷,研究較多的是稀有人參皂苷Rg3、Rh2、Rh1以及苷元原人參二醇和原人參三醇,在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、促使腫瘤細(xì)胞分化、提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性以及提高機(jī)體抗腫瘤免疫力方面均有顯著作用。然而,稀有人參皂苷Rk3的抗腫瘤藥理活性尚未見報道。該研究通過體內(nèi)體外實驗探討人參皂苷Rk3對肝癌的作用。體內(nèi)采用裸鼠建立肝癌模型,觀察人參皂苷Rk3對腫瘤大小的影響;體外觀察其對HepG2細(xì)胞株凋亡的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 細(xì)胞株和動物 人肝癌細(xì)胞株(HepG2)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;清潔級Balb/c裸鼠,16~20 g,雌雄各半,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

        1.1.2 試劑 人參皂苷Rk3購自大連美侖生物技術(shù)有限公司,有效成分≥98%;5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 5-Fu)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,有效成分=99%;胎牛血清購自杭州四季青公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;TRIzol購自美國Sigma公司;Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Ferments公司;小鼠抗β-actin抗體購自美國 Santa Cruze公司;Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5抗體購自武漢博士德公司;Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4、DR5引物由上海生工生物工程有限公司合成。

        1.1.3 主要儀器 MK3型酶標(biāo)儀(荷蘭雷勃公司);SW-CJ-IF型超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);PCR擴(kuò)增儀(德國Eppedorf公司);Bio-rad電泳儀(美國伯樂公司);COULTZER EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng),待細(xì)胞生長至70%~80%密度時進(jìn)行傳代。

        1.2.2 HepG2荷瘤鼠肝癌模型的建立 取對數(shù)期細(xì)胞1×107~5×107/ml 200 μl接種于裸鼠右腋部皮下。第4周給予人參皂苷Rk3(25、50、100 mg/kg)和5-Fu(20 mg/kg)灌胃,生理鹽水組給予等體積的生理鹽水,連續(xù)灌胃4周;8周后處死裸鼠取出瘤體,測量瘤體重量。

        1.2.3 細(xì)胞增殖試驗 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以1×108/ml的細(xì)胞密度接種于96孔板,每孔約100 μl,37 ℃過夜。待細(xì)胞完全貼壁后加入人參皂苷Rk3(0、5、10、20、40、80 μmol/L),分別作用6、12、24、48 h后,棄去培養(yǎng)基,換無血清培養(yǎng)液,然后每孔加MTT(5 mg/ml) 20 μl,37 ℃繼續(xù)孵育4 h后,棄上清液并每孔加150 μl DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶,室溫振蕩溶解10 min后,于492 nm波長處測吸光度(absorbance,A)值。

        1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取不同濃度的人參皂苷處理后的HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后;1 200 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,棄培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次;用400 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5 μl Annexin V染液,輕輕混勻后于2~8 ℃避光孵育15 min;加入10 μl PI后輕輕混勻,于2~8 ℃避光條件下孵育5 min;上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,實驗重復(fù)3次。

        1.2.5 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5的蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞,加入400 μl含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min后;4 ℃、12 000 r/min離心30 min;取上清液加入SDS上樣緩沖液,99.9 ℃變性10 min。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,室溫5%脫脂牛奶孵育3 h后;一抗孵育過夜后,二抗孵育1 h,ECL發(fā)光試劑盒顯影。

        1.2.6 RT-PCR法檢測Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5的mRNA表達(dá) 使用TRIzol法提取HepG2細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃變性40 s,51~58 ℃ 復(fù)性40 s,72 ℃延伸 1 min,35個循環(huán)。引物序列見表1。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測光密度。

        2 結(jié)果

        2.1 人參皂苷Rk3對HepG2荷瘤鼠瘤體重量的影響 與生理鹽水組比較,人參皂苷Rk3(100 mg/kg)能夠明顯降低腫瘤的重量(F=56.6,P<0.05)。 見表2。

        表1 引物序列

        表2 人參皂苷Rk3對HepG2荷瘤鼠瘤體重量的影響

        2.2 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞增殖的影響 與未加人參皂苷Rk3比較,人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)在24、48、72 h能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖(F=38.4、48.5、69.7,P<0.05)。人參皂苷Rk3隨著藥物作用時間延長和濃度增加抑制HepG2細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。見圖1。

        2.3 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V和PI雙標(biāo)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示,與正常組(3±0.32)%比較,人參皂苷Rk3 20 μmol/L組(13±1.31)%、40 μmol/L組(17±1.92)%和80 μmol/L組(25±2.92)%能夠明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 見圖2。

        圖1 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞增殖的影響

        圖2 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

        2.4 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR和Western blot結(jié)果見圖3、4,給予不同濃度的人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)后,Bax、cleved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA和蛋白明顯增加(P<0.05);Bcl-2的mRNA和蛋白顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

        3 討論

        人參皂苷 Rk3是從人參炮制品紅參藥材中分離提純的一種單體,為四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷。

        圖3 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 mRNA表達(dá)的影響

        M:Marker;A~D:人參皂苷Rk3 0、20、40、80 μmol/L; E: 5-Fu 50 μg/ml;與人參皂苷Rk3 0 μmol/L比較:**P<0.01

        Quan et al[11]通過體外實驗證明,稀有人參皂苷Rk3對胰腺癌、白血病、結(jié)腸癌等細(xì)胞株的增殖有明顯抑制作用。

        本研究顯示,人參皂苷Rk3能夠顯著抑制HepG2荷瘤鼠肝癌模型中腫瘤的重量。同時, MTT結(jié)果顯示人參皂苷Rk3 (20、40、80 μmol/L)在24、48、72 h能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖,并隨著藥物作用時間延長和濃度增加抑制HepG2細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。為了觀察人參皂苷Rk3對HepG2凋亡的影響,本研究使用Annexin V和PI雙標(biāo)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果顯示人參皂苷Rk3(20、40、80 μmol/L)能夠增加HepG2細(xì)胞凋亡,同時cleaved-Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高。

        死亡受體分子DR4和DR5與TRAIL結(jié)合后,通過招募Caspase-8傳遞死亡信號,能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。本研究顯示給予人參皂苷Rk3后,DR4和DR5的表達(dá)明顯增加,提示人參皂苷Rk3能夠誘導(dǎo)HepG2的凋亡可能與DR4和DR5有關(guān)。Bcl-2是一種原癌基因,能夠增強(qiáng)細(xì)胞對大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性,抑制細(xì)胞的凋亡,而其同源的Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。Bax的過表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明人參皂苷Rk3能夠降低Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá),增加Bax的表達(dá)。上述結(jié)果提示,人參皂苷Rk3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡可能是通過上調(diào)DR4、DR5及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

        圖4 人參皂苷Rk3對HepG2細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、DR4和DR5 蛋白表達(dá)的影響

        A~D:人參皂苷Rk3 0、20、40、80 μmol/L; E: 5-Fu 50 μg/ml; 與人參皂苷Rk3 0 μmol/L比較:*P<0.05,**P<0.01

        綜上所述,本研究結(jié)果證實人參皂苷Rk3對荷瘤鼠肝癌有一定的抑制作用,并可能通過影響DR4、DR5和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡,但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

        [1] 陳建國. 中國肝癌發(fā)病趨勢和一級防護(hù)[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012,28(4):256-60.

        [2] 白陽秋, 丁光偉, 楊玉秀, 等. 肝癌發(fā)生過程中的差異基因表達(dá)[J]. 世界華人消化雜志, 2008, 16(22):2537-41.

        [3] 陳建斌, 魏思東, 陳國勇, 等. 索拉菲尼聯(lián)合雷帕霉素治療肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的療效觀察[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2015,25(2):56-9.

        [4] Wang Y, Wang C M, Jiang Z Z, et al. MicroRNA-34c targets TGFB-induced factor homeobox 2, represses cell proliferation and induces apoptosis in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015, 10(5):3095-102.

        [5] 何金花, 黎毓光, 張 鵬, 等. 原花青素聯(lián)合Apollon siRNA抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡[J]. 安徽醫(yī)藥, 2013, 17(4):552-5.

        [6] Yun T K, Lee Y S, Lee Y H, et al. Antcarcinogenic effect of Panax ginseng C.A. Meyer and identification of active compounds[J]. J Korean Med Sci, 2001, 12(16): 6-18.

        [7] Junmin S,Hongxiang L,Zhen L, et al. Ginsenoside Rg3 inhibits colon cancer cell migration by suppressing nuclear factor kappa B activity[J]. J Tradit Chin Med,2015, 35(4):440-4.

        [8] Guan N,Huo X,Zhang Z, et al. Ginsenoside Rh2 inhibits metastasis of glioblastoma multiforme through Akt-regulated MMP13[J]. Tumour Biol,2015, 36(9):6789-95.

        [9] 張樹臣.中國人參[M]. 上海:上??萍冀逃霭嫔?1992:93.

        [10]王本祥.人參的研究[M]. 北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1984:1-101.

        [11]Quan K, Liu Q, Wan J Y, et al. Rapid preparation of rare ginsenosides by acid transformation and their structure-activity relationships against cancer cells[J]. Sci Rep, 2015, 16(5):8598-604.

        [12]Park C, Jeong J S, Jeong J W, et al. Ethanol extract of Kalopanax septemlobus leaf induces caspase-dependent apoptosis associated with activation of AMPK in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Int J Oncol, 2016, 48(1):261-70.

        [13]劉郁東, 鄭啟新, 吳宏斌, 等. 雷帕霉素對不同腫瘤Bax/Bcl-2和活性caspase-3表達(dá)的影響[J]. 腫瘤, 2013, 33(2):138-43.

        Effect of ginsenoside Rk3 on apoptosis of HepG2

        Fan Jie1,2,3, Zhang Lei1,2, Wang Xiao4

        (1SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032;2AnhuiProvincialKeyLaboratoryofNatureMedicines,Hefei230032;3PharmaceuticalPreparationSection,TonglingPeople’sHospital,Tongling244000;4DeptofRadiology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

        ObjectiveTostudytheeffectofginsenosideRk3onapoptosisofHepG2.MethodsTumorbearingmice model of liver cancer was prepared inoculating HepG2 cells in axilla of nude mice subcutaneously. The nude mice were grouped into saline group, ginsenoside Rk3 (25, 50 ,100 mg/kg) group and 5-Fu (20 mg/kg) groupinvivo. And the HepG2 cells were divided into normal group, ginsenoside Rk3(20, 40, 80 μmol/L) group and 5-Fu(50 μg/ml) groupinvitro. The inhibition rate of HepG2 cells was evaluated by MTT assay. The apoptosis distribution of HepG2 cells was detected by flow cytomtric analysis. The mRNA expressions of Bax, Bcl-2, cleaved- Caspase-3, DR4 and DR5 in HepG2 cells were detected by RT-PCR. The protein expressions of Bax, Bcl-2 cleaved-Caspase-3, DR4 and protein in HepG2 cells were observed by Western blot.ResultsGinsenoside Rk3(100 mg/kg) significantly inhibited tumor weight(P<0.05). Ginsenoside Rk3(20, 40 and 80 μmol/L) significantly inhibited the proliferation and induced apoptosis in HepG2 cells. Ginsenoside Rk3(20, 40 and 80 μmol/L) significantly increased Bax, cleaved-Caspase-3 DR4 expression and DR5 mRNA and protein, reduced the expression of Bcl-2 mRNA and protein. The difference was statistically significant.ConclusionGinsenoside Rk3 can induce apoptosis of HepG2 cells possibly through the DR4 and DR5.

        ginsenoside Rk3; HepG2; apoptosis

        國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(編號:81100302);安徽高校省級自然科學(xué)研究重點項目(編號:KJ2014A124)

        1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,合肥 2300322安徽省天然藥物活性成分研究重點實驗室,合肥 2300323銅陵市人民醫(yī)院藥劑科,銅陵 2440004安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科,合肥 230022

        范 潔,女,主管藥師,碩士研究生; 張 磊,女,副教授,碩士生導(dǎo)師,責(zé)任作者,E-mail:zhangl@ahmu.edu.cn; 王 嘯,男,博士,副主任醫(yī)師,責(zé)任作者,E-mail:hfwangxiao@aliyun.com

        時間:2016-10-12 13:23:00

        http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.011.html

        R -332; R 735.7

        A

        1000-1492(2016)11-1604-05

        10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.011

        2016-06-10接收

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