潘曉莉，李代禧，魏冬青

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離子液體中胰島素結構穩(wěn)定性的分子動力學模擬

潘曉莉1，李代禧1，魏冬青2

（1上海理工大學食品科學與工程研究所，上海 200093；2上海交通大學微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

離子液體作為一種新型綠色溶劑，由于其獨特的物理化學性質，被廣泛應用于蛋白質的穩(wěn)定性研究。選用熱敏性蛋白藥物胰島素作為研究對象，采用分子動力學模擬方法，從分子層面上研究不同種類的離子液體對胰島素結構的穩(wěn)定效果。結果表明，與純水體系相比，在常溫下離子液體能夠有效地穩(wěn)定胰島素的分子結構，且體系中陰離子的氫鍵堿性越弱，陽離子的烷基鏈越短，對胰島素分子結構的穩(wěn)定作用越強。并深入分析不同烷基鏈長度的二氰胺類離子液體與胰島素之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相較于長烷基鏈離子液體，短烷基鏈離子液體與胰島素之間的相互作用更強，揭示了后者能更好地維持和穩(wěn)定胰島蛋白的分子結構。

離子液體；胰島素；蛋白質穩(wěn)定性；相互作用能；分子模擬

引 言

隨著生物技術的發(fā)展，蛋白類藥物已成為生物技術新藥的主要類型，并逐步轉為商業(yè)化生產(chǎn)。然而，蛋白質的不穩(wěn)定性極大程度地限制了其醫(yī)學以及商業(yè)應用[1-2]。由此，對熱敏性蛋白藥物穩(wěn)定性的不斷探索一直是生物制藥領域的研究熱點。胰島素具有降低血糖的功能，是很多糖尿病患者的必備藥物。同時，它也是一種非常典型的熱敏性蛋白藥物[3]。胰島素常以六聚體的結構存在，作為緩釋劑，但以單體結構發(fā)揮其生理功能。胰島素單體在常溫下極其不穩(wěn)定，常因其結構變性而失去生物活性[4]。

與傳統(tǒng)的有機溶劑相比，離子液體具有其獨特的理化性質，如極低的熔點和蒸氣壓、高極性和熱穩(wěn)定性、可調的溶解能力等。作為一種新型“綠色溶劑”，離子液體已經(jīng)被廣泛應用于蛋白質的穩(wěn)定性研究[5-6]。許多實驗結果表明蛋白質在離子液體中具有良好的穩(wěn)定性[7-12]。例如在[chol][dhp]（膽堿磷酸二氫鹽）中，HAS（人血清蛋白）的三級折疊結構保持不變[10]；另有報道木瓜蛋白酶在[Emim][BF4]（1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽）中具有較高的催化活性[11]。此外，Yao等[12]考察二元離子液體對蛋白質的穩(wěn)定性影響時，發(fā)現(xiàn)脂肪酶的活性結構在[C4mim][PF6]（1-丁基-3-甲基咪唑六氟硼酸鹽）- [C4mim][BF4]（1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽）混合體系中得到較好的保持。因此，研究離子液體的性質與熱敏性蛋白藥物穩(wěn)定性之間的關系，對離子液體的分子設計及蛋白質的穩(wěn)定保護具有重要意義。

本文以胰島素單體為研究對象，選擇10種不同種類的離子液體作為溶劑，采用分子動力學模擬（molecular dynamic，MD）方法[13]，從分子層面上探討離子液體氫鍵堿性的強弱及烷基鏈的長短與胰島蛋白結構穩(wěn)定性之間的差異性。以期突破實驗研究的局限性，并與國際上提出的“綠色化學”接軌，對研究離子液體穩(wěn)定熱敏性蛋白藥物具有一定的參考作用。

1 實驗部分

1.1 結構的準備

本文選用了10種咪唑類離子液體： [C4mim][NO3]（1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽）、[C4mim][CH3SO3] （1-丁基-3-甲基咪唑甲基磺酸鹽）、[C4mim][Cl] （1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽）、[C4mim][OAC]（1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽）和[Cmim] [DCA]（4, 6, 8, 10, 12, 14）（1-烷基-3-甲基咪唑二氰胺鹽）。所有的離子液體初始分子結構（圖1）均取自于Chemical數(shù)據(jù)庫，并利用Gaussian09軟件包在HF/6-31G* 方法下進行結構優(yōu)化，得到最終的離子液體結構[14]。

圖1 離子液體的分子結構

胰島素的初始結構取自于PDB數(shù)據(jù)庫（ID：3inc[15]），刪除其他原子得到經(jīng)二硫鍵共價鍵合的胰島素單體，如圖2所示。

圖2 胰島素的初始三維結構

1.2 模擬過程

分子動力學模擬方法采用Gromacs5.0.5[16]軟件包，其中胰島蛋白選用Amber99sb-ildn[17]分子力場，離子液體選用Amber[18]通用分子力場，水分子選用Tip4p[19]模型。本次模擬中，時間步長設定為2fs，范德華分子間相互作用和靜電相互作用的截斷均設為1.0nm，靜電相互作用的遠程修正采用PME（particle mesh Ewald）[20]方法。系統(tǒng)壓力采用Berendsen[21]方法控制為1個標準大氣壓，并將velocity-rescal[22]方法用于溫度的控制，模擬溫度設為300K。

首先，建立一個10 nm×10 nm×10 nm的周期性體系，在每個體系中分別添加1個胰島素單體分子、400個離子液體及相應的抗衡離子，共構建了10個不同種類的離子液體體系，各體系組成如表1所示。另外構建了胰島素的純水體系作為參考體系。每個體系均采用最速下降法[23]進行1 ns的結構優(yōu)化，接著在NPT系綜下進行10 ns的限制性分子動力學模擬，使離子液體或水分子在胰島素周圍均勻分布。然后在相同系綜下對體系進行常規(guī)分子動力學模擬，所有體系的模擬時間長度為60 ns。取最后5 ns的模擬軌跡用于分析胰島素的結構保護結果。

表1 不同種類離子液體體系的組成

2 結果和討論

2.1 不同氫鍵堿性的離子液體對熱敏性蛋白穩(wěn)定性的影響

2.1.1 [C4mim]系列離子液體體系中胰島素的整體構象變化分析 均方根偏差[24]（root mean square deviation，RMSD）可以反映特定構象與初始結構的相似程度，其值越低，表明特定構象與初始結構的差異性越小[25]。通過計算各體系中胰島素的RMSD值（圖3）表征不同氫鍵堿性的離子液體對熱敏性蛋白構象的穩(wěn)定性影響。由圖3可知，相較于純水體系，離子液體體系中胰島素的RMSD值大幅度降低，且隨著離子液體氫鍵堿性的減弱（[OAC]-＞[Cl]-＞[CH3SO3]-＞[NO3]-＞[DCA]-）[26]，RMSD值降低的幅度增加。這說明離子液體能有效穩(wěn)定胰島素的分子結構，且氫鍵堿性較弱的離子液體對胰島蛋白表現(xiàn)出更優(yōu)的穩(wěn)定效果。而氫鍵堿性較強的離子液體對胰島素呈現(xiàn)出較弱的穩(wěn)定性，是因為離子液體的氫鍵堿性越強，越容易破壞維持蛋白質高級有序結構的作用力，導致蛋白質分子構象的穩(wěn)定性降低[26-27]。

圖3 各體系中胰島素的RMSD值

2.1.2 [C4mim]系列離子液體體系中胰島素的二級結構差異性分析 胰島素的RMSD值體現(xiàn)蛋白質整體結構的變化，要得到離子液體氫鍵堿性的強弱對胰島素局部結構的影響，還需對各體系中胰島素的二級結構進行分析。因此，通過DSSP[28]（definition of secondary structure of proteins）軟件統(tǒng)計了蛋白質二級結構的構象變化，結果如圖4所示。從圖中可以看出，與初始結構相比，純水體系中胰島素的α-螺旋數(shù)目大幅度減少，其無規(guī)則卷曲數(shù)目則大幅度增加；而在不同氫鍵堿性的離子液體中，胰島素的二級結構并未大量轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲，這表明相較于純水體系，離子液體具有穩(wěn)定蛋白質分子結構的作用。特別是在氫鍵堿性較弱的[C4mim][DCA]體系中，胰島素的二級結構幾乎和初始結構一致，說明該種離子液體對蛋白質的二級結構具有良好的保護效果。但隨著離子液體氫鍵堿性的增強（[NO3]-＜[CH3SO3]-＜[Cl]-＜[OAC]-），胰島素的α-螺旋數(shù)目呈減少趨勢，β-轉角數(shù)目隨之增加。表明離子液體的氫鍵堿性影響胰島蛋白二級結構的穩(wěn)定性，氫鍵堿性越強，二級結構的穩(wěn)定性越弱。

圖4 各體系中胰島素二級結構的變化

2.2 不同長度烷基鏈的離子液體對蛋白質的穩(wěn)定性影響

2.2.1 [DCA]系列離子液體體系中胰島素的結構差異性分析 離子液體對蛋白質的穩(wěn)定性由陰、陽離子的理化性質共同決定。由2.1節(jié)可得，氫鍵堿性較弱的[C4mim][DCA]更能穩(wěn)定熱敏性蛋白藥物的分子結構。因此，為了探討離子液體的烷基鏈長度對蛋白質的穩(wěn)定性影響，計算不同長度烷基鏈的[DCA]類離子液體體系中胰島素的RMSD值（圖5）。在[Cmim][DCA]（4～14）體系中，隨著離子液體烷基鏈長度的增加（值增加），胰島蛋白的RMSD值呈上升趨勢，且當烷基鏈上的碳原子個數(shù)≥10時，該值上升的幅度變大。說明胰島蛋白的穩(wěn)定性與離子液體的烷基鏈長度密切相關，短烷基鏈咪唑類離子液體能有效穩(wěn)定胰島素的分子結構，當陽離子的烷基鏈較長時，離子液體對胰島素的穩(wěn)定效果明顯減弱。

圖5 各體系中胰島素的RMSD值

Yan等[29]用熒光光譜法研究在一系列不同長度烷基鏈的離子液體中α-胰凝乳蛋白酶的活性和穩(wěn)定性，得出該酶能穩(wěn)定存活于[Cmim][Br]（4, 6, 8）（1-烷基-3-甲基咪唑溴鹽）中，相反地，在[C10mim][Br]中該酶的催化活性較大程度地降低。婁文勇等[11]通過高效液相色譜法研究離子液體的組成對木瓜蛋白酶活性的影響時，發(fā)現(xiàn)在[Cmim][BF4]（2～6）（1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽）介質中，酶活性隨著離子液體烷基鏈長度的縮短而提高。這些實驗結果與本文通過分子動力學模擬方法研究得出胰島素在短烷基鏈咪唑類離子液體中穩(wěn)定性更優(yōu)的結果一致，表明短烷基鏈離子液體確實更能穩(wěn)定胰島蛋白的分子結構。

為深入分析蛋白質在不同長度烷基鏈離子液體中的結構差異性，詳細統(tǒng)計了不同烷基鏈長度的離子液體體系中胰島素二級結構數(shù)目的變化，結果示于圖6。從圖中可以觀察到，相較于初始結構，[Cmim][DCA] (4～ 8)體系中胰島蛋白的二級結構均未發(fā)生較大變化；而在[Cmim][DCA]（10～14）體系中，隨著離子液體烷基鏈長度的持續(xù)增加，蛋白質的α-螺旋數(shù)目呈降低趨勢，其β-轉角及無規(guī)則卷曲數(shù)目均隨之小幅度升高。這說明短烷基鏈離子液體能夠有效穩(wěn)定胰島蛋白的二級結構；相反地，長烷基鏈離子液體體系中蛋白質的二級結構發(fā)生了一定程度的變化，且隨著烷基鏈長度的增加，變化越劇烈。

圖6 各體系中胰島素二級結構的變化

2.2.2 [DCA]系列離子液體體系中離子液體與胰島素之間的相互作用分析 離子液體通過與胰島素之間的相互作用發(fā)揮其穩(wěn)定熱敏性蛋白活性結構的功能。分別計算[DCA]系列離子液體體系中陰離子、陽離子與胰島素之間的相互作用能[圖7(a)]，表征不同烷基鏈長度的離子液體與蛋白質之間的相互作用強度。觀察圖7(a)可知，隨著陽離子烷基鏈長度的持續(xù)縮短，陽離子、陰離子與胰島蛋白之間的相互作用能均增大，且陽離子烷基鏈越長，對陰離子與胰島素之間相互作用能的影響越大。圖7(b)描述了不同長度烷基鏈離子液體體系中胰島素表面與陽離子之間的徑向分布函數(shù)，第一個峰的峰值表示二者之間最強的相互作用[30]。由()分析得出，隨著體系中烷基鏈長度的持續(xù)增大，第一個峰的峰值呈降低的趨勢，且當烷基鏈上的碳原子個數(shù)≥10時，該峰值降低幅度增大。這說明與長烷基鏈咪唑類離子液體相比，短烷基鏈咪唑類離子液體與胰島素之間呈現(xiàn)出更強的相互作用。這些數(shù)據(jù)表明相較于長烷基鏈離子液體，短烷基鏈離子液體通過較強的相互作用吸附和覆蓋在胰島素的表面，有效穩(wěn)定熱敏性蛋白胰島素的分子結構。這也驗證了2.2.1節(jié)中胰島蛋白結構穩(wěn)定性的分析結果。

圖7 各體系中陰、陽離子與胰島素之間的相互作用

(a) total energy between cations, anions and insulin; (b) radial distribution function between canion and surface of insulin

為了進一步闡釋離子液體的烷基鏈長度如何影響離子液體與胰島素之間的相互作用，分別計算體系中陽離子的1-甲基咪唑基和烷基與胰島素之間的相互作用能（表2）。分析表2可得，6個體系中1-甲基咪唑基與胰島素之間的相互作用能均遠大于烷基與胰島素之間的。說明陽離子主要依靠其1-甲基咪唑基與胰島素之間的相互作用穩(wěn)定蛋白質的分子結構，這可能是由于陽離子的正電荷主要分布在其1-甲基咪唑基上。為此分別分析了陽離子中1-甲基咪唑基和烷基與胰島素之間的非鍵相互作用，結果如表2所示。比較表中數(shù)據(jù)可得，陽離子的1-甲基咪唑基與胰島素之間的靜電相互作用大于范德華相互作用；相反地，陽離子的烷基與胰島素之間的主要相互作用為范德華相互作用。這證實了之前得出的猜想，陽離子的正電荷分布在咪唑環(huán)靠近甲基的N原子上，從而使帶一個正電荷的1-甲基咪唑基與胰島素表面的負電勢氨基酸形成較強的靜電相互作用；而陽離子的烷基部分幾乎呈電中性，通過較弱的范德華相互作用吸附在胰島蛋白表面。

Note:total—total interaction energy;ele—electrostatic interaction energy;vdw—van der Waals interaction energy.

長烷基鏈[C14mim][DCA]體系中陽離子與胰島蛋白表面的直接吸附作用（圖8）表明，與胰島蛋白表面有直接吸附作用的是陽離子的1-甲基咪唑基，其烷基部分并未全部吸附在蛋白質的表面。進一步揭示了離子液體的1-甲基咪唑基與胰島素之間形成的靜電吸引作用提供了一種約束作用，抑制了蛋白質的伸展變化，有利于其結構的穩(wěn)定。

圖8 [C14mim][DCA]體系中陽離子與胰島素表面直接吸附作用示意圖

(blue part represents surface of insulin; purple part represents stick model of cation; green circles represent adsorption between surface of insulin and cation)

2.2.3 [DCA]系列離子液體體系中胰島素與離子液體之間的接觸數(shù) 接觸數(shù)是指分子間發(fā)生相互作用的原子接觸個數(shù)，該參數(shù)被用來表征兩分子之間相互作用的強弱[31]。因此，通過Gromacs中的mindist程序分別計算了胰島素與陰離子和陽離子的1-甲基咪唑基之間的接觸數(shù)[32]（如圖9），表征胰島素與陰、陽離子之間的相互作用強度。

觀察圖9可得，隨著陽離子烷基鏈長度的增加，胰島素與陰離子和陽離子的1-甲基咪唑基之間的接觸數(shù)均呈降低趨勢，說明胰島素與陰、陽離子之間的相互作用強度均隨著陽離子烷基鏈長度的增加而減弱。這是因為長烷基鏈陽離子的結構較大，使體系中陰、陽離子吸附在胰島蛋白表面的概率均較小，二者之間的原子接觸數(shù)也較少，導致陰、陽離子與胰島素之間的相互作用能較低（見圖7）。這揭示了離子液體的烷基鏈長度較大程度地影響其與蛋白質之間的相互作用強度，陽離子結構較小的短烷基鏈咪唑類離子液體與胰島素之間具有較強的相互作用，進而顯示出對熱敏性蛋白藥物更好的保護性。

圖9 胰島素與陰離子和陽離子的1-甲基咪唑基之間的接觸數(shù)

3 結 論

本文利用分子動力學模擬方法，從分子水平上闡釋了離子液體氫鍵堿性的強弱及烷基鏈的長短對熱敏性蛋白藥物胰島素穩(wěn)定性的影響。分析結果表明，離子液體，特別是氫鍵堿性較弱且烷基鏈較短的離子液體能有效穩(wěn)定胰島素的分子結構。離子液體的陽離子主要依靠其1-甲基咪唑基與胰島素之間的靜電相互作用穩(wěn)定蛋白質的分子結構。且相較于長烷基鏈[DCA]離子液體，分子結構較小的短烷基鏈[DCA]離子液體與胰島素之間的相互作用更強，進一步揭示了短烷基鏈咪唑類離子液體對蛋白質的穩(wěn)定效果更優(yōu)。

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Structural stability of insulin in imidazolium ionic liquids by molecular simulation

PAN Xiaoli1, LI Daixi1, WEI Dongqing2

(1Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;2State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Ionic liquids, as a kind of novel green solvents, have been widely applied to structural stability study of protein due to their unique physicochemical properties. In this study, insulin was chosen as a heat-sensitive protein medicine to research the structural stability of protein in various imidazolium ionic liquids from a molecular insight by using molecular dynamics simulation. The results indicate that the ionic liquids are able to stabilize the molecular structure of insulin effectively at room temperature compared with aqueous solution. The RMSD values and the secondary structure of insulin show that the weaker the hydrogen-bond basicity of anion is, the shorter the alkyl chain of cation is, the more stable the molecular structure of insulin is. In order to explain thoroughly the effect of alkyl chain length of ionic liquid on the stability of the protein, the interaction and the number of contact between the insulin and dicyanamide imidazolium ionic liquids with different alkyl chain length are further analyzed. It is found that the cation stabilize effectively the molecular structure of insulin which relies mainly on the electrostatic interaction between the insulin and the 1-methylimidazole of cation. Comparing to ionic liquids with long alkyl chain, the interaction between the insulin and ionic liquids is more powerful, and the insulin also adsorb more anion and 1-methylimidazole of cation in ionic liquids with short alkyl chain. All these results indicate that the ionic liquids with short chain alkyl indeed improve the molecular structural stability of insulin. Generally, the molecular dynamic simulation, as adopted to this research, provides a molecular insight to investigate the stability of insulin in ionic liquids, which is important and essential for molecular design of ionic liquids and stability study of heat-sensitive protein drugs.

ionic liquids; insulin; protein stability; interaction energy; molecular simulation

date: 2016-07-11.

Prof. LI Daixi,dxli75@126.com

10.11949/j.issn.0438-1157.20160968

O 6-39

A

0438—1157（2016）12—5215—07

上海市重點學科項目（T0503，P0502）；上海市自然科學基金項目（12ZR1420400）；上海市“創(chuàng)新行動計劃”國際科技合作項目（12430702000）；上海市聯(lián)盟計劃項目；上海理工大學人文社會科學基金項目（11XSY23）。

supported by the Shanghai Leading Academic Discipline Project (T0503, P0502), the Natural Science Foundation of Shanghai (12ZR1420400), the “Innovation Action Plan” International Science and Technology Cooperation Project of Shanghai (12430702000), Shanghai Alliance Program and the Humanities and Social Science Fund Project of University of Shanghai for Science and Technology (11XSY23).

2016-07-11收到初稿，2016-08-22收到修改稿。

聯(lián)系人：李代禧。第一作者：潘曉莉（1991—），女，碩士研究生。