陶文雅 朱 峰 王 晨 徐 韋

（蘇州大學附屬第三醫(yī)院肝膽外科 江蘇 常州 213000）

膽結(jié)石主要是指發(fā)生在膽囊內(nèi)的結(jié)石，其主要成分為膽固醇。膽結(jié)石患者的臨床表現(xiàn)主要為腹痛、厭食油膩食物等，其生活質(zhì)量可受到嚴重的影響[1]。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，美國約有2000萬的膽結(jié)石患者，每年用于治療此病的醫(yī)藥費用約為560億美元[2]。目前，我國尚無關于膽結(jié)石的流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)，但估計此病的發(fā)病率應在4%-7%之間。膽結(jié)石的病因較多，主要包括體形肥胖、長期禁食、服用避孕藥、攝入過多的低纖維食物及發(fā)生代謝綜合征等。研究結(jié)果證實[3]，向心性肥胖、糖尿病及其并發(fā)癥、心血管疾病等代謝相關性疾病均與膽結(jié)石的發(fā)病有密切的關系。胰島素抵抗是誘發(fā)代謝綜合征和糖尿病的關鍵性因素。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗與膽結(jié)石的發(fā)病也有一定的關系，但其誘發(fā)膽結(jié)石的病理機制尚不明確。為了分析肝臟胰島素抵抗誘發(fā)膽結(jié)石的機制，我們將肝臟胰島素受體被敲除的C57BL/6小鼠作為模型小鼠，將健康的C57小鼠作為正常小鼠，對比觀察兩種小鼠在攝入高脂飲食后發(fā)生膽結(jié)石的情況、在攝入正常飲食時其體內(nèi)膽汁酸的分泌量、其膽汁酸合成相關酶、法尼酯衍生物X受體（FXR）、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Abcg5和Abcg8 的表達、其肝臟和膽汁中膽固醇的濃度及膽汁的膽固醇飽和指數(shù)（CSI）等指標，現(xiàn)將相關的情況報告如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

本實驗所用的模型小鼠為肝胰島素受體被敲除的C57BL/6小鼠，由南京大學模式動物中心提供，屬于SPF級雄性小鼠，其體重在18-22g之間。本實驗所用的正常C57小鼠由中國科學院上海實驗動物中心提供，屬于SPF級雄性小鼠，其體重在18-22g之間，其許可證號為SCXK（滬）2007-0005。

1.2 實驗試劑及儀器

胰島素注射液（購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；Trizol（購自invitrogen公司）；RIPA裂解液（購自碧云天生物技術(shù)研究所）；FXR羊抗鼠一抗以及兔抗山羊二抗（購自美國Santa cruz公司）；SYBRgreen、ECL發(fā)光液（購自北京天根生物科技有限公司）；膽酸、膽固醇檢測試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）；Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀（購自瑞士Roche公司）；Bio-Rad western blot系統(tǒng)（購自美國Bio-Rad公司）；酶標儀（購自美國Thermo Fisher公司）。

2 方法

2.1 實驗方法

1）取正常小鼠和模型小鼠各20只，為其中10只正常小鼠和10只模型小鼠皮下注射胰島素，1 IU/d，共用藥3周；為另外10只正常小鼠和10只模型小鼠皮下注射蒸餾水，1 IU/d，共用藥3周。將這40只小鼠用高脂飲食（含0.5%的膽酸、1%的膽固醇及15%的脂肪乳）進行飼養(yǎng)，在第3周后將其處死，取其膽汁進行檢查。小鼠的膽汁內(nèi)若有肉眼可見的粗大顆粒，而且在光鏡下可見大團塊的膽固醇結(jié)晶可判定其發(fā)生膽結(jié)石。觀察并統(tǒng)計這些小鼠發(fā)生膽結(jié)石的情況。2）取正常小鼠及模型小鼠各10只，分別收集其糞便，用試劑盒檢測其糞便中膽汁酸的含量。取這些小鼠的肝組織100 mg，經(jīng)液氮研磨處理后加 入Trizol，提取出RN A，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲 得cDNA，使用PCR分別檢測其中膽汁酸合成相關酶Cyp7a1、 Cyp8b1、Cyp7b1、Cyp27a1、法尼酯衍生物X受體（farnesoid-X-receptor，F(xiàn)XR）、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Abcg5和Abcg8 的mRNA表達，以GAPDH作為內(nèi)參進行Ct值的統(tǒng)計。取這些小鼠的肝組織100 mg，經(jīng)研磨后使用RIPA裂解液進行裂解，制備成western blot實驗樣本，經(jīng)聚丙烯凝膠酰胺電泳分離后轉(zhuǎn)膜、封閉，采用FXR抗體進行孵育，用ECL發(fā)光液進行顯色，用Bio-Rad機進行信號讀取，用GELsoftware軟件獲取結(jié)果（以GAPDH作為內(nèi)參）。3）取正常小鼠及模型小鼠各10只，分別收集其肝組織及膽汁，用試劑盒檢測其肝組織和膽汁中膽固醇的濃度，采用Carey表計算其膽汁的膽固醇飽和指數(shù)（Choleesterol saturation index, CSI）。

2.2 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對本實驗中的數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用平均值±標準差（）表示，組間比較采用方差分析及t檢驗，計數(shù)資料以%表示，采用x2檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對正常小鼠及模型小鼠攝入高脂飲食后發(fā)生膽結(jié)石情況的分析

將模型小鼠用高脂飼料飼養(yǎng)3周后，共有83%的小鼠發(fā)生膽結(jié)石，可見胰島素受體被敲除的小鼠易發(fā)生膽結(jié)石。在注射胰島素后，正常小鼠及模型小鼠膽結(jié)石的發(fā)生率均有所增高，模型小鼠膽結(jié)石的發(fā)生率達100%。可見，為小鼠注射胰島素可誘發(fā)高胰島素血癥，加重其發(fā)生的胰島素抵抗，加速其體內(nèi)膽結(jié)石的形成。詳情見圖1。

圖1 對各組小鼠在攝入高脂飲食后膽結(jié)石發(fā)生率的分析

3.2 正常小鼠及模型小鼠在攝入正常飲食時其體內(nèi)膽汁酸的水平及膽汁酸相關合成基因的表達

與正常小鼠相比，模型小鼠體內(nèi)膽汁酸的分泌量明顯較 少（P＜ 0.05）， 其 體 內(nèi) Cyp7a1、 Cyp8b1、 Cyp7b1和Cyp27a1的mRNA表達明顯降低（P＜0.05），其體內(nèi)FXR的mRNA表達與蛋白表達也明顯降低（P＜0.05）?？梢?，發(fā)生肝臟胰島素抵抗的小鼠可因體內(nèi)膽汁酸的分泌減少而減弱機體對膽結(jié)石的消化及清除能力。詳情見圖2。

圖2 兩組小鼠體內(nèi)膽汁酸的含量（A）、Cyp7a1、Cyp8b1、 Cyp7b1和 Cyp27a1 的 mRNA 表達（B）、FXR 的mRNA表達（C）和蛋白表達（D）

3.3 對正常小鼠及模型小鼠肝臟和膽汁中膽固醇濃度的檢測結(jié)果分析

與正常小鼠相比，模型小鼠的肝膽固醇的濃度和CSI均較高（P＜0.05），其體內(nèi)Abcg5和Abcg8的mRNA表達及蛋白表達也較高（P＜0.05）。可見，發(fā)生肝臟胰島素抵抗的小鼠可因體內(nèi)Abcg5、Abcg8的表達增高、膽汁中的膽固醇增多而加速膽結(jié)石的形成。詳情見圖3。

圖3 兩組小鼠體內(nèi)CSI（A）、肝組織中膽固醇的含量（B）、Abcg5和Abcg8的 mRNA表達（C）及蛋白表達（D）

4 討論

胰島素抵抗與膽結(jié)石的形成之間有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，膽結(jié)石在正常人群中的發(fā)病率不到10%，在糖尿病患者中的發(fā)病率在30%以上[4]。

在本研究中，我們采用肝胰島素受體被敲除的小鼠作為胰島素抵抗模型小鼠，為其最大限度地進行了肝臟發(fā)生胰島素抵抗的實驗[5]。在攝入高脂飲食3周后，模型小鼠膽結(jié)石的發(fā)生率是正常小鼠的8倍?？梢?，發(fā)生肝臟胰島素抵抗可顯著增加小鼠膽結(jié)石的發(fā)病率。據(jù)報道，肝臟胰島素抵抗導致膽結(jié)石的病理機制主要有以下幾種[6]：1）肝臟在發(fā)生胰島素抵抗后，肝臟內(nèi)膽固醇合成的限速酶HMGGOA還原酶的活性可顯著增高，進而促進肝臟內(nèi)膽固醇的合成。2）肝臟在發(fā)生胰島素抵抗后可抑制膽汁酸的分泌及膽鹽的合成，促進膽結(jié)石的形成。3）肝臟在發(fā)生胰島素抵抗后，LDL（低密度脂蛋白）的活性可顯著增高，進而可增加膽汁中膽固醇的含量及膽汁中鈣離子的含量。我們在本次研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟胰島素抵抗導致膽結(jié)石的病理機制還包括以下兩個：1）肝臟在發(fā)生胰島素抵抗后，膽固醇轉(zhuǎn)運體Abcg5和Abcg8的表達可急劇升高，膽汁內(nèi)膽固醇的含量也隨之升高，進而可導致膽結(jié)石。2）肝臟在發(fā)生胰島素抵抗后，調(diào)節(jié)膽汁酸合成的分子FXR[7]的表達可顯著降低，膽汁酸的分泌可顯著減少，進而可減弱機體對膽結(jié)石的消化能力。合成膽汁酸是動物體內(nèi)進行膽固醇代謝的主要途徑，Cyp7a1、 Cyp8b1、 Cyp7b1和 Cyp27al均會參與膽汁酸的合成，而這些分子又受到FXR的調(diào)控[8]。膽汁中膽固醇偏高與膽結(jié)石的發(fā)病有直接的關系。膽汁中膽固醇的分泌主要受膽固醇轉(zhuǎn)運體Abcg5和Abcg8的調(diào)節(jié)。Abcg5和Abcg8的表達水平升高可導致轉(zhuǎn)運至膽汁中的膽固醇增多，進而可促進膽結(jié)石的形成[9]。

本研究的結(jié)果顯示，將模型小鼠用高脂飼料飼養(yǎng)3周后，其中有83%的小鼠發(fā)生膽結(jié)石。與正常小鼠相比，模型小鼠體內(nèi)膽汁酸的分泌量明顯較少（P＜0.05），其體內(nèi)Cyp7a1、 Cyp8b1、 Cyp7b1和 Cyp27a1的 mRNA 表 達 明 顯降低（P＜0.05），其體內(nèi)FXR的mRNA表達與蛋白表達也明顯降低（P＜0.05）。與正常小鼠相比，模型小鼠體內(nèi)肝膽固醇的濃度和CSI均較高（P＜0.05），其體內(nèi)Abcg5和Abcg8的mRNA表達及蛋白表達也較高（P＜0.05）?？梢姡l(fā)生肝臟胰島素抵抗的小鼠可因FXR、Cyp7a1、 Cyp8b1、Cyp7b1和Cyp27a1的表達降低，膽汁酸的分泌減少及Abcg5和Abcg8的表達升高，導致膽汁中膽固醇的濃度增加而加速膽結(jié)石的發(fā)病。