章曄敏，邵一凡，熊妍妍，毛貴珠，陳小娥*，方旭波，2，傅鵬程

（1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江舟山316022；3.舟山海圣生物有限公司，浙江舟山316112）

響應面法優(yōu)化鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的發(fā)酵條件

章曄敏1，邵一凡1，熊妍妍1，毛貴珠1，陳小娥1*，方旭波1，2，傅鵬程3

（1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江舟山316022；3.舟山海圣生物有限公司，浙江舟山316112）

以殼聚糖酶活力為評價指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對鹿皮曲霉(Aspergillus cervinus)ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明，最佳發(fā)酵條件為膠體殼聚糖1.5%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，麩皮2%，Tween-80 0.06%，發(fā)酵時間96 h，發(fā)酵溫度30℃，初始pH 5.9，接種量3%。在此最佳條件下，最終測得殼聚糖酶平均酶活為8.26 U/mL，是優(yōu)化前(2.05 U/mL)的4.03倍。

殼聚糖酶；鹿皮曲霉ZJOU-AC1；響應面法；優(yōu)化

殼聚糖（chitosan）是由自然界廣泛存在的幾丁質經(jīng)脫乙酰作用得到的一種多糖，被譽為繼蛋白質、糖類、維生素、脂肪等生命元素之外的第六大生命物質[1]。殼聚糖及其降解產(chǎn)物殼寡糖（chitooligosaccharides）都具有較好的生物活性，在食品、醫(yī)藥、化工等很多行業(yè)都受到高度重視[2-5]。然而殼聚糖為天然高分子物質，存在晶體結構緊密，水溶性差，不易被吸收等缺點，使其在開發(fā)利用上存在局限。而降解產(chǎn)物殼寡糖水溶性強、易吸收，也具有清除體內垃圾、免疫激活、抗腫瘤等功效[6-7]，應用前景十分廣闊。

目前降解殼聚糖的方法主要有化學法、物理法及生物酶解法[7-9]。其中化學法制得產(chǎn)率低，降解產(chǎn)物聚合度小，產(chǎn)物純化難，且對環(huán)境污染嚴重不符合當代推崇的綠色科學。酶解法降解條件反應溫和，殼寡糖的得率高、生物活性強，又綠色環(huán)保，是最理想的制備方法。因此，用生物酶解法來降解殼聚糖已成為生產(chǎn)功能性殼聚糖的首選方法。殼聚糖酶主要分布于細菌、真菌、放線菌等[10-12]微生物體內，且微生物主要是通過土壤或海水篩選[10，13-14]得到。本研究從浙江省舟山市毗鄰常年養(yǎng)殖蝦蟹的廠家生產(chǎn)場地的山坡及海域篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株，最終得到一株高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株—鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1，可作為高產(chǎn)殼聚糖酶的新菌株進行研究。

響應面法是優(yōu)化微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程中常用的一種方法[15-16]。陳桂光等[17]采用響應面法對產(chǎn)殼聚糖酶菌株煙曲霉（Aspergillus fumigatus）K1的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，酶活較之前提高了2.4倍；劉杰等[18]在殼聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化過程中，利用響應面優(yōu)化的方式使發(fā)酵液中殼聚糖含量較優(yōu)化前提高了4.32倍，產(chǎn)酶周期縮短了23～47 h；陳靜等[19]利用響應面法優(yōu)化了產(chǎn)殼聚糖酶菌株—蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）ZJOU-010的培養(yǎng)條件，并研究得出蝦加工副產(chǎn)物可作為單一碳、氮源用于生產(chǎn)殼寡糖。本研究以鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1作為研究對象，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)殼聚糖酶，利用單因素試驗和響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件，以期為工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)殼聚糖酶菌株提供新型的技術支持和應用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1：由生工生物工程上海股份有限公司鑒定，本實驗室分離保藏。

1.1.2 試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥90%）：浙江普陀興業(yè)藥業(yè)有限公司提供；酵母粉（LP0021）：英國OXOID公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽（glucosaminehydrochloride，GAH）：美國Sigma公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）：國藥集團藥業(yè)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，麩皮1%，膠體殼聚糖0.2%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸銨0.2%硫酸鎂0.05%，自然pH，121℃滅菌20 min。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體殼聚糖1%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，麩皮2%，pH5.5，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設備

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HHS電熱恒溫水浴鍋：上海棱光技術有限公司；BS110電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；JZ-Ⅱ四方均質器：鐵道部電化院四方電氣設備廠；DGC-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：北京林茂科技有限公司；UV-6000紫外分光光度計：蘇州江東精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖酶活測定方法

參照陳小娥等[12]的方法并略做改動。將發(fā)酵液4000r/min離心10 min，取1 mL上清液，稀釋適當倍數(shù)，加入1 mL 0.5%的膠體殼聚糖，在50℃恒溫水浴鍋中反應15 min后，立即加入2 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴8 min，馬上冷卻，加2 mL水，4 000 r/min離心10 min，取上清液在波長510 nm處比色，測吸光度值A510nm。滅活酶液按照上述方法同樣處理作為對照扣除發(fā)酵液殘?zhí)?。以蒸餾水加DNS為空白。以氨基葡萄糖鹽酸鹽含量（x）為自變量，吸光度值A510nm（y）值為應變量繪制出標準曲線，獲得回歸方程y=0.001x-0.084 8（R2=0.999 1），根據(jù)該方程計算并折算成酶活。

殼聚糖酶活單位定義為：在50℃下，每分鐘產(chǎn)生1μmol氨基葡萄糖鹽酸鹽所需要的酶量為一個酶活單位（U/mL）。

1.3.2 菌株活化及種子液的制備

鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化后，挑取適量菌體接入種子培養(yǎng)基中，25℃150r/min下?lián)u床培養(yǎng)20～30h，然后以2%的接種量接入原始發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。在25℃、裝液量75mL/250mL、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h。

1.3.3 最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基研究

（1）最適碳源的選擇

用相同濃度的葡萄糖、乳糖、膠體殼聚糖、淀粉、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖6種碳源來代替原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，在0.5%～2.5%范圍內按照發(fā)酵液酶活選取最佳碳源濃度。

（2）最適氮源的選擇

在優(yōu)化碳源的基礎上，分別以0.2%的硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、氯化銨、酵母粉、蛋白胨6種氮源來代替原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，在0.1%～1.0%范圍內按照發(fā)酵液酶活選取最佳氮源濃度。

（3）最適表面活性劑濃度的選擇

在原始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的表面活性劑Tween-80，進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過檢測發(fā)酵液酶活得出最適表面活性劑濃度。

1.3.4 單因素試驗探究產(chǎn)酶發(fā)酵條件

初始pH對產(chǎn)酶的影響：接種量2%，其他條件均不變，調整原始發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.5，25℃條件下發(fā)酵72 h，測定殼聚糖酶活力。

發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響：接種量2%，初始pH 5.5，原始發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵時間分別調整為48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h，其他條件均不變，25℃條件下進行發(fā)酵，測定殼聚糖酶活力。

發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響：接種量2%，初始pH 5.5，其他條件均不變，調整發(fā)酵溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，發(fā)酵72 h，測定殼聚糖酶活力。

接種量對產(chǎn)酶的影響：初始pH 5.5，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%在25℃、150r/min進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵72 h，測定殼聚糖酶活力。

1.3.5 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取對酶活影響更顯著的3個因素為自變量，采用Design-Expert8.0.6設計3因素3水平的Box-Behnken試驗，得出各因素對菌株A.cervinusZJOU-AC1產(chǎn)酶的影響及最佳發(fā)酵條件。

2 結果與分析

2.1 最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.1.1 最適碳源及其添加量的確定

分別以1%的葡萄糖、乳糖、淀粉、膠體殼聚糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖作為碳源進行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，考察不同碳源對產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結果見表1。

表1 不同碳源對殼聚糖酶酶活力的影響Table 1 Effects of different carbon sources on chitoanase activity

微生物產(chǎn)殼聚糖酶為誘導酶，底物殼聚糖的存在是產(chǎn)殼聚糖酶的必要條件。由表2可知，在6種碳源中，氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖作為碳源，菌株ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶酶活較低，不利于誘導產(chǎn)殼聚糖酶。膠體殼聚糖作為碳源誘導A.cervinusZJOU-AC1菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力最高，膠體殼聚糖是菌株ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的高效誘導劑，因此，選取膠體殼聚糖作為最適碳源。考察不同含量膠體殼聚糖對產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結果見圖1。

圖1 膠體殼聚糖含量對殼聚糖酶酶活力的影響Fig.1 Effect of colloid chitosan concentration on chitoanase activity

由圖1可知，酶活隨膠體殼聚糖含量的增大，先升高后降低。在0.5%～1.5%范圍內，酶活隨膠體殼聚糖含量的增大逐漸升高，當膠體殼聚糖含量為1.5%時，酶活最高。繼續(xù)增加膠體殼聚糖含量，酶活開始降低，這可能是由于膠體殼聚糖含量高，黏度大，影響了發(fā)酵液中的溶解氧含量從而導致菌體量的減少，酶活降低。故選取1.5%的膠體殼聚糖為最適碳源含量。

2.1.2 最適氮源及其含量的確定

分別以0.2%含量的硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、氯化銨、酵母粉、蛋白胨作為氮源進行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，考察不同氮源對產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結果見表2。

表2 不同氮源對殼聚糖酶酶活力的影響Table 2 Effects of different nitrogen sources on chitoanase activity

由表2可知，以硫酸銨和酵母粉作為氮源時，菌體產(chǎn)殼聚糖酶的效果較好。但兩者所對應酶活相差甚小，考慮經(jīng)濟成本，選取硫酸銨作為最適氮源?？疾觳煌苛蛩徜@對產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，結果見圖2。

圖2 硫酸銨濃度對殼聚糖酶活力的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentration on chitoanase activity

由圖2可知，酶活隨硫酸銨含量的增大，先升高后降低，當硫酸銨的含量為0.4%時，酶活最高。在0.1%～0.4%時，酶活一直處于升高趨勢，繼續(xù)增大硫酸銨濃度，酶活反而降低，這可能是因為硫酸銨為0.4%時，發(fā)酵液中碳氮比最佳，有利于產(chǎn)酶，超過0.4%后，碳氮比發(fā)生變化影響菌體的生長和產(chǎn)酶，從而導致酶活降低。故選取0.4%硫酸銨為最適氮源添加量。

2.1.3 最適表面活性劑的濃度

表面活性劑可改變微生物細胞結構，提高細胞膜滲透性，促使酶向胞外分泌[20]。由表3可知，隨表面活性劑Tween-80濃度的增加，可提高菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力，當Tween-80濃度為0.06%時，產(chǎn)殼聚糖酶活為（5.53±0.22）U/mL。因此選擇Tween-80添加量為0.06%。

表3 Tween-80含量對殼聚糖酶活力的影響Table 3 Effect of Tween-80 concentration on chitoanase activity

2.2 單因素實驗探究發(fā)酵條件

2.2.1 初始pH對產(chǎn)酶活力的影響

考察發(fā)酵液初始pH對鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨初始pH在5.0～6.0的范圍增加，發(fā)酵液中殼聚糖酶活逐漸增加；當發(fā)酵液初始pH值為6.0時，菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力最高，為7.48 U/mL；當初始pH繼續(xù)增加時，酶活急劇下降，其原因可能是因為pH增大導致部分膠體殼聚糖絮凝不利于被菌株利用從而影響產(chǎn)酶。故選擇初始pH值為6.0為宜。

圖3 初始pH對殼聚糖酶活力的影響Fig.3 Effect of initial pH on chitoanase activity

2.2.2 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶活力的影響

考察發(fā)酵時間對鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時間對殼聚糖酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on chitoanase activity

由圖4可知，在48 h～96 h范圍內，發(fā)酵液酶活隨著發(fā)酵時間的延長逐步提升，當發(fā)酵時間為120 h時，發(fā)酵液中殼聚糖酶活達到最高點，為6.68 U/mL；120 h以后酶活隨著時間的延長顯著降低，造成該現(xiàn)象的原因可能為發(fā)酵時間過長進入微生物生長的衰亡期，也有可能為培養(yǎng)基內營養(yǎng)物質消耗殆盡，代謝廢物增多導致菌體自溶明顯。比較最高點與96 h對應點的酶活，兩者相差不大，綜合考慮選擇最適發(fā)酵時間為96 h。

發(fā)酵時間相比其他3個因素，酶活達到最高點前的最高值與最低值的變化較小，且本研究采用的菌種發(fā)酵產(chǎn)酶時間較長，探究時間對實驗進度影響較大，綜合考慮在響應面試驗中將不對發(fā)酵時間進行優(yōu)化。

2.2.3 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

考察發(fā)酵溫度對鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，結果如圖5所示。

由圖5可知，發(fā)酵液酶活力隨著發(fā)酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，當發(fā)酵溫度為30℃時，發(fā)酵液中酶活力達到最大值，為6.26 U/mL。因此選取30℃為最適發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對殼聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on chitoanase activity

2.2.4 接種量對產(chǎn)酶活力的影響

考察接種量對鹿皮曲霉ZJOU-AC1發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，結果如圖6所示。

圖6 接種量對殼聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculum on chitoanase activity

由圖6可知，發(fā)酵液的酶活力隨著接種量的增加先升高后降低，這是由于接種量過大時，菌體生長快，在相同的時間內，菌體總數(shù)過大，培養(yǎng)基營養(yǎng)不夠，易衰老；接種量過小時，則菌體生長慢，在相同的時間內，菌體總數(shù)少，產(chǎn)酶少。當接種量為3%時，發(fā)酵液酶活力達到最大值，為7.33 U/mL。因此最適接種量為3%。

2.3 響應面法優(yōu)化菌株產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 響應面設計方案及分析結果

在單因素試驗基礎上，以殼聚糖酶活力（Y）為響應值，選取對A.cervinusZJOU-AC1產(chǎn)酶發(fā)酵影響較大的發(fā)酵溫度（A）、初始pH（B）、接種量（C）3個因素，設計N=17的Box-Behnken試驗，結果見表4。運用Design Expert 8.0.6軟件程序對表4試驗結果進行二次回歸響應面分析，建立多元二次響應面回歸模型：

為檢驗模型的有效性，對其進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表5和表6。結果表明，回歸模型的P值＜0.000 1，失擬項P=0.8712＞0.05，表明模型極顯著且試驗誤差較小。對酶活回歸方程檢驗，模型的決定系數(shù)為R2=0.981 0，說明模型擬合程度良好；變異系數(shù)（coefficientof variation，CV）= 7.30%，說明模型能較好地反應真實試驗值。因此可用該模型來預測酶活。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

分析模型的各系數(shù)P值，因素B、A2對酶活影響顯著（P＜0.05），因素B2、C2對酶活影響極顯著（P＜0.000 1），其他因素對酶活影響不顯著。3個因素對產(chǎn)酶高低的影響順序為：初始pH（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞接種量（C）。

表5 Box-Behnken試驗設計方差分析Table 5 Variance analysis of Box-Behnken experiments design

表6 回歸模型的可信度分析Table 6 Credibility analysis of regression model

根據(jù)響應面回歸方程得到各因素的響應面立體分析結果見圖7。由圖7可知，初始pH對應的響應面曲線較為陡峭，說明初始pH對酶活的影響較大，這與方差分析結果相符，并且各參數(shù)間的響應面呈橢圓型，交互作用較顯著，響應面曲線開口向下，能清晰地看到最高點。

圖7 發(fā)酵時間、初始pH值和接種量對殼聚糖酶活交互影響的曲面圖和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of the effects of interaction between fermentation temperature,initial pH and inoculum on chitoanase activity

2.3.2 響應面試驗結果預測和驗證

根據(jù)響應面試驗結果對殼聚糖酶活進行回歸分析預測得到液體發(fā)酵菌株A.cervinusZJOU-AC1最佳產(chǎn)酶條件為初始pH值5.93，發(fā)酵溫度29.58℃，接種量2.98%，由回歸方程預測酶活力為8.47 U/mL?；谠囼灢僮骺尚行?，將預測值調整為發(fā)酵溫度30℃，初始pH值5.9，接種量3%。在此最佳條件下進行重復液體發(fā)酵試驗3次，最終測得酶活平均值為8.26 U/mL，與理論值相對誤差為2.54%，表明回歸方程能較好地預測實驗值，即該響應面對菌株A.cervinus ZJOU-AC1的發(fā)酵條件的優(yōu)化準確可行。

3 結論

本研究通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化了產(chǎn)殼聚糖酶菌株A.cervinusZJOU-AC1的發(fā)酵條件。優(yōu)化后A.cervinus ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：膠體殼聚糖1.5%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，麩皮2%，Tween-80 0.06%；最優(yōu)發(fā)酵條件為：初始pH 5.9，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間96 h，接種量為3%，搖瓶裝液量為75mL/250mL，搖床轉速為150r/min。在此條件下，A.cervinus ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶活平均可達到8.26 U/mL，是之前（2.05 U/mL）的4.03倍。從可持續(xù)發(fā)展角度看，針對近幾年水產(chǎn)品加工企業(yè)以含大量殼聚糖為首的副產(chǎn)物（蝦殼、蟹殼等）日益增多所造成的環(huán)境問題，這一生產(chǎn)工藝既能減少環(huán)境污染而且具有較高的經(jīng)濟價值，應用前景廣泛。

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[20]REDDY R,REDDY P,SEENAYYA G.Enhanced production of thermostableβ-amylase and pullulanase in the presence of surfactants by Clostridium thermosulfurogenesSV2[J].Process Biochem,1999,34(1): 87-92.

Optimization of fermentation conditions of chitosanase-producingAspergillus cervinus ZJOU-AC1 by response surface methodology

ZHANG Yemin1,SHAO Yifan1,XIONG Yanyan1,MAO Guizhu1,CHEN Xiaoe1*,FANG Xubo1,2,FU Pengcheng3
(1.College of Food and Medinel,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China;2.State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province,Zhoushan 316022,China;3.Zhoushan Haisheng Biotechnology Co.Ltd.,Zhoushan 316112,China)

Using chitosanase activity as the evaluation index,on the basis of single factor experiments,the fermentation conditions ofAspergillus cervinusZJOU-AC1 for chitosanase production were optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum fermentation conditions were obtained as followed:colloid chitosan 1.5%,ammonium sulfate 0.4%,monopotassium phosphate 0.2%,magnesium sulfate 0.05%,bran 2%,Tween-80 0.06%,fermentation time 96 h,fermentation temperature 30℃,initial pH value 5.9 and inoculum 3%.Under the optimum conditions, the average chitosanase activity was 8.26 U/ml,which was 4.03 times that of before optimization(2.05 U/ml).

chitosanase;Aspergillus cervinusZJOU-AC1;response surface methodology;optimization

Q815

0254-5071（2016）11-0093-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.019

2016-07-09

舟山市科技局項目（2015C41016）；浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目（2016R4 11033）

章曄敏（1995-），女，本科生，研究方向為食品科學與工程。

*通訊作者：陳小娥（1968-），女，教授，博士，研究方向為海洋生物資源綜合利用。