章曄敏，邵一凡，熊妍妍，毛貴珠，陳小娥*，方旭波，2，傅鵬程

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316022；3.舟山海圣生物有限公司，浙江舟山316112）

響應(yīng)面法優(yōu)化鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的發(fā)酵條件

章曄敏1，邵一凡1，熊妍妍1，毛貴珠1，陳小娥1*，方旭波1，2，傅鵬程3

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316022；3.舟山海圣生物有限公司，浙江舟山316112）

以殼聚糖酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)鹿皮曲霉(Aspergillus cervinus)ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為膠體殼聚糖1.5%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，麩皮2%，Tween-80 0.06%，發(fā)酵時(shí)間96 h，發(fā)酵溫度30℃，初始pH 5.9，接種量3%。在此最佳條件下，最終測(cè)得殼聚糖酶平均酶活為8.26 U/mL，是優(yōu)化前(2.05 U/mL)的4.03倍。

殼聚糖酶；鹿皮曲霉ZJOU-AC1；響應(yīng)面法；優(yōu)化

殼聚糖（chitosan）是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰作用得到的一種多糖，被譽(yù)為繼蛋白質(zhì)、糖類、維生素、脂肪等生命元素之外的第六大生命物質(zhì)[1]。殼聚糖及其降解產(chǎn)物殼寡糖（chitooligosaccharides）都具有較好的生物活性，在食品、醫(yī)藥、化工等很多行業(yè)都受到高度重視[2-5]。然而殼聚糖為天然高分子物質(zhì)，存在晶體結(jié)構(gòu)緊密，水溶性差，不易被吸收等缺點(diǎn)，使其在開(kāi)發(fā)利用上存在局限。而降解產(chǎn)物殼寡糖水溶性強(qiáng)、易吸收，也具有清除體內(nèi)垃圾、免疫激活、抗腫瘤等功效[6-7]，應(yīng)用前景十分廣闊。

目前降解殼聚糖的方法主要有化學(xué)法、物理法及生物酶解法[7-9]。其中化學(xué)法制得產(chǎn)率低，降解產(chǎn)物聚合度小，產(chǎn)物純化難，且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重不符合當(dāng)代推崇的綠色科學(xué)。酶解法降解條件反應(yīng)溫和，殼寡糖的得率高、生物活性強(qiáng)，又綠色環(huán)保，是最理想的制備方法。因此，用生物酶解法來(lái)降解殼聚糖已成為生產(chǎn)功能性殼聚糖的首選方法。殼聚糖酶主要分布于細(xì)菌、真菌、放線菌等[10-12]微生物體內(nèi)，且微生物主要是通過(guò)土壤或海水篩選[10，13-14]得到。本研究從浙江省舟山市毗鄰常年養(yǎng)殖蝦蟹的廠家生產(chǎn)場(chǎng)地的山坡及海域篩選產(chǎn)殼聚糖酶菌株，最終得到一株高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株—鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1，可作為高產(chǎn)殼聚糖酶的新菌株進(jìn)行研究。

響應(yīng)面法是優(yōu)化微生物發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中常用的一種方法[15-16]。陳桂光等[17]采用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶菌株煙曲霉（Aspergillus fumigatus）K1的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，酶活較之前提高了2.4倍；劉杰等[18]在殼聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化過(guò)程中，利用響應(yīng)面優(yōu)化的方式使發(fā)酵液中殼聚糖含量較優(yōu)化前提高了4.32倍，產(chǎn)酶周期縮短了23～47 h；陳靜等[19]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了產(chǎn)殼聚糖酶菌株—蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）ZJOU-010的培養(yǎng)條件，并研究得出蝦加工副產(chǎn)物可作為單一碳、氮源用于生產(chǎn)殼寡糖。本研究以鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1作為研究對(duì)象，進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)殼聚糖酶，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，以期為工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)殼聚糖酶菌株提供新型的技術(shù)支持和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1：由生工生物工程上海股份有限公司鑒定，本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2 試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥90%）：浙江普陀興業(yè)藥業(yè)有限公司提供；酵母粉（LP0021）：英國(guó)OXOID公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽（glucosaminehydrochloride，GAH）：美國(guó)Sigma公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，麩皮1%，膠體殼聚糖0.2%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸銨0.2%硫酸鎂0.05%，自然pH，121℃滅菌20 min。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體殼聚糖1%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，麩皮2%，pH5.5，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HHS電熱恒溫水浴鍋：上海棱光技術(shù)有限公司；BS110電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；JZ-Ⅱ四方均質(zhì)器：鐵道部電化院四方電氣設(shè)備廠；DGC-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：北京林茂科技有限公司；UV-6000紫外分光光度計(jì)：蘇州江東精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖酶活測(cè)定方法

參照陳小娥等[12]的方法并略做改動(dòng)。將發(fā)酵液4000r/min離心10 min，取1 mL上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，加入1 mL 0.5%的膠體殼聚糖，在50℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min后，立即加入2 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴8 min，馬上冷卻，加2 mL水，4 000 r/min離心10 min，取上清液在波長(zhǎng)510 nm處比色，測(cè)吸光度值A(chǔ)510nm。滅活酶液按照上述方法同樣處理作為對(duì)照扣除發(fā)酵液殘?zhí)恰Ｒ哉麴s水加DNS為空白。以氨基葡萄糖鹽酸鹽含量（x）為自變量，吸光度值A(chǔ)510nm（y）值為應(yīng)變量繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程y=0.001x-0.084 8（R2=0.999 1），根據(jù)該方程計(jì)算并折算成酶活。

殼聚糖酶活單位定義為：在50℃下，每分鐘產(chǎn)生1μmol氨基葡萄糖鹽酸鹽所需要的酶量為一個(gè)酶活單位（U/mL）。

1.3.2 菌株活化及種子液的制備

鹿皮曲霉（Aspergillus cervinus）ZJOU-AC1經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化后，挑取適量菌體接入種子培養(yǎng)基中，25℃150r/min下?lián)u床培養(yǎng)20～30h，然后以2%的接種量接入原始發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。在25℃、裝液量75mL/250mL、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h。

1.3.3 最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基研究

（1）最適碳源的選擇

用相同濃度的葡萄糖、乳糖、膠體殼聚糖、淀粉、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖6種碳源來(lái)代替原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在0.5%～2.5%范圍內(nèi)按照發(fā)酵液酶活選取最佳碳源濃度。

（2）最適氮源的選擇

在優(yōu)化碳源的基礎(chǔ)上，分別以0.2%的硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、氯化銨、酵母粉、蛋白胨6種氮源來(lái)代替原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在0.1%～1.0%范圍內(nèi)按照發(fā)酵液酶活選取最佳氮源濃度。

（3）最適表面活性劑濃度的選擇

在原始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的表面活性劑Tween-80，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵液酶活得出最適表面活性劑濃度。

1.3.4 單因素試驗(yàn)探究產(chǎn)酶發(fā)酵條件

初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響：接種量2%，其他條件均不變，調(diào)整原始發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.5，25℃條件下發(fā)酵72 h，測(cè)定殼聚糖酶活力。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響：接種量2%，初始pH 5.5，原始發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵時(shí)間分別調(diào)整為48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h，其他條件均不變，25℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定殼聚糖酶活力。

發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響：接種量2%，初始pH 5.5，其他條件均不變，調(diào)整發(fā)酵溫度為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，發(fā)酵72 h，測(cè)定殼聚糖酶活力。

接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響：初始pH 5.5，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%在25℃、150r/min進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵72 h，測(cè)定殼聚糖酶活力。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)酶活影響更顯著的3個(gè)因素為自變量，采用Design-Expert8.0.6設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，得出各因素對(duì)菌株A.cervinusZJOU-AC1產(chǎn)酶的影響及最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.1.1 最適碳源及其添加量的確定

分別以1%的葡萄糖、乳糖、淀粉、膠體殼聚糖、氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，考察不同碳源對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同碳源對(duì)殼聚糖酶酶活力的影響Table 1 Effects of different carbon sources on chitoanase activity

微生物產(chǎn)殼聚糖酶為誘導(dǎo)酶，底物殼聚糖的存在是產(chǎn)殼聚糖酶的必要條件。由表2可知，在6種碳源中，氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖作為碳源，菌株ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶酶活較低，不利于誘導(dǎo)產(chǎn)殼聚糖酶。膠體殼聚糖作為碳源誘導(dǎo)A.cervinusZJOU-AC1菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力最高，膠體殼聚糖是菌株ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的高效誘導(dǎo)劑，因此，選取膠體殼聚糖作為最適碳源?？疾觳煌磕z體殼聚糖對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 膠體殼聚糖含量對(duì)殼聚糖酶酶活力的影響Fig.1 Effect of colloid chitosan concentration on chitoanase activity

由圖1可知，酶活隨膠體殼聚糖含量的增大，先升高后降低。在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，酶活隨膠體殼聚糖含量的增大逐漸升高，當(dāng)膠體殼聚糖含量為1.5%時(shí)，酶活最高。繼續(xù)增加膠體殼聚糖含量，酶活開(kāi)始降低，這可能是由于膠體殼聚糖含量高，黏度大，影響了發(fā)酵液中的溶解氧含量從而導(dǎo)致菌體量的減少，酶活降低。故選取1.5%的膠體殼聚糖為最適碳源含量。

2.1.2 最適氮源及其含量的確定

分別以0.2%含量的硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、氯化銨、酵母粉、蛋白胨作為氮源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，考察不同氮源對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同氮源對(duì)殼聚糖酶酶活力的影響Table 2 Effects of different nitrogen sources on chitoanase activity

由表2可知，以硫酸銨和酵母粉作為氮源時(shí)，菌體產(chǎn)殼聚糖酶的效果較好。但兩者所對(duì)應(yīng)酶活相差甚小，考慮經(jīng)濟(jì)成本，選取硫酸銨作為最適氮源?？疾觳煌苛蛩徜@對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 硫酸銨濃度對(duì)殼聚糖酶活力的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate concentration on chitoanase activity

由圖2可知，酶活隨硫酸銨含量的增大，先升高后降低，當(dāng)硫酸銨的含量為0.4%時(shí)，酶活最高。在0.1%～0.4%時(shí)，酶活一直處于升高趨勢(shì)，繼續(xù)增大硫酸銨濃度，酶活反而降低，這可能是因?yàn)榱蛩徜@為0.4%時(shí)，發(fā)酵液中碳氮比最佳，有利于產(chǎn)酶，超過(guò)0.4%后，碳氮比發(fā)生變化影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，從而導(dǎo)致酶活降低。故選取0.4%硫酸銨為最適氮源添加量。

2.1.3 最適表面活性劑的濃度

表面活性劑可改變微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜滲透性，促使酶向胞外分泌[20]。由表3可知，隨表面活性劑Tween-80濃度的增加，可提高菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力，當(dāng)Tween-80濃度為0.06%時(shí)，產(chǎn)殼聚糖酶活為（5.53±0.22）U/mL。因此選擇Tween-80添加量為0.06%。

表3 Tween-80含量對(duì)殼聚糖酶活力的影響Table 3 Effect of Tween-80 concentration on chitoanase activity

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)探究發(fā)酵條件

2.2.1 初始pH對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

考察發(fā)酵液初始pH對(duì)鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨初始pH在5.0～6.0的范圍增加，發(fā)酵液中殼聚糖酶活逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵液初始pH值為6.0時(shí)，菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力最高，為7.48 U/mL；當(dāng)初始pH繼續(xù)增加時(shí)，酶活急劇下降，其原因可能是因?yàn)閜H增大導(dǎo)致部分膠體殼聚糖絮凝不利于被菌株利用從而影響產(chǎn)酶。故選擇初始pH值為6.0為宜。

圖3 初始pH對(duì)殼聚糖酶活力的影響Fig.3 Effect of initial pH on chitoanase activity

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶酶活力的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)殼聚糖酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on chitoanase activity

由圖4可知，在48 h～96 h范圍內(nèi)，發(fā)酵液酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐步提升，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為120 h時(shí)，發(fā)酵液中殼聚糖酶活達(dá)到最高點(diǎn)，為6.68 U/mL；120 h以后酶活隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低，造成該現(xiàn)象的原因可能為發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)進(jìn)入微生物生長(zhǎng)的衰亡期，也有可能為培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，代謝廢物增多導(dǎo)致菌體自溶明顯。比較最高點(diǎn)與96 h對(duì)應(yīng)點(diǎn)的酶活，兩者相差不大，綜合考慮選擇最適發(fā)酵時(shí)間為96 h。

發(fā)酵時(shí)間相比其他3個(gè)因素，酶活達(dá)到最高點(diǎn)前的最高值與最低值的變化較小，且本研究采用的菌種發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間較長(zhǎng)，探究時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度影響較大，綜合考慮在響應(yīng)面試驗(yàn)中將不對(duì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

考察發(fā)酵溫度對(duì)鹿皮曲霉ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，發(fā)酵液酶活力隨著發(fā)酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，發(fā)酵液中酶活力達(dá)到最大值，為6.26 U/mL。因此選取30℃為最適發(fā)酵溫度。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)殼聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on chitoanase activity

2.2.4 接種量對(duì)產(chǎn)酶活力的影響

考察接種量對(duì)鹿皮曲霉ZJOU-AC1發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 接種量對(duì)殼聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculum on chitoanase activity

由圖6可知，發(fā)酵液的酶活力隨著接種量的增加先升高后降低，這是由于接種量過(guò)大時(shí)，菌體生長(zhǎng)快，在相同的時(shí)間內(nèi)，菌體總數(shù)過(guò)大，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不夠，易衰老；接種量過(guò)小時(shí)，則菌體生長(zhǎng)慢，在相同的時(shí)間內(nèi)，菌體總數(shù)少，產(chǎn)酶少。當(dāng)接種量為3%時(shí)，發(fā)酵液酶活力達(dá)到最大值，為7.33 U/mL。因此最適接種量為3%。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株產(chǎn)殼聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及分析結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以殼聚糖酶活力（Y）為響應(yīng)值，選取對(duì)A.cervinusZJOU-AC1產(chǎn)酶發(fā)酵影響較大的發(fā)酵溫度（A）、初始pH（B）、接種量（C）3個(gè)因素，設(shè)計(jì)N=17的Box-Behnken試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件程序?qū)Ρ?試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?，?duì)其進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。結(jié)果表明，回歸模型的P值＜0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.8712＞0.05，表明模型極顯著且試驗(yàn)誤差較小。對(duì)酶活回歸方程檢驗(yàn)，模型的決定系數(shù)為R2=0.981 0，說(shuō)明模型擬合程度良好；變異系數(shù)（coefficientof variation，CV）= 7.30%，說(shuō)明模型能較好地反應(yīng)真實(shí)試驗(yàn)值。因此可用該模型來(lái)預(yù)測(cè)酶活。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

分析模型的各系數(shù)P值，因素B、A2對(duì)酶活影響顯著（P＜0.05），因素B2、C2對(duì)酶活影響極顯著（P＜0.000 1），其他因素對(duì)酶活影響不顯著。3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶高低的影響順序?yàn)椋撼跏紁H（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞接種量（C）。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 5 Variance analysis of Box-Behnken experiments design

表6 回歸模型的可信度分析Table 6 Credibility analysis of regression model

根據(jù)響應(yīng)面回歸方程得到各因素的響應(yīng)面立體分析結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，初始pH對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面曲線較為陡峭，說(shuō)明初始pH對(duì)酶活的影響較大，這與方差分析結(jié)果相符，并且各參數(shù)間的響應(yīng)面呈橢圓型，交互作用較顯著，響應(yīng)面曲線開(kāi)口向下，能清晰地看到最高點(diǎn)。

圖7 發(fā)酵時(shí)間、初始pH值和接種量對(duì)殼聚糖酶活交互影響的曲面圖和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of the effects of interaction between fermentation temperature,initial pH and inoculum on chitoanase activity

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果對(duì)殼聚糖酶活進(jìn)行回歸分析預(yù)測(cè)得到液體發(fā)酵菌株A.cervinusZJOU-AC1最佳產(chǎn)酶條件為初始pH值5.93，發(fā)酵溫度29.58℃，接種量2.98%，由回歸方程預(yù)測(cè)酶活力為8.47 U/mL?；谠囼?yàn)操作可行性，將預(yù)測(cè)值調(diào)整為發(fā)酵溫度30℃，初始pH值5.9，接種量3%。在此最佳條件下進(jìn)行重復(fù)液體發(fā)酵試驗(yàn)3次，最終測(cè)得酶活平均值為8.26 U/mL，與理論值相對(duì)誤差為2.54%，表明回歸方程能較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)值，即該響應(yīng)面對(duì)菌株A.cervinus ZJOU-AC1的發(fā)酵條件的優(yōu)化準(zhǔn)確可行。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了產(chǎn)殼聚糖酶菌株A.cervinusZJOU-AC1的發(fā)酵條件。優(yōu)化后A.cervinus ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：膠體殼聚糖1.5%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，麩皮2%，Tween-80 0.06%；最優(yōu)發(fā)酵條件為：初始pH 5.9，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間96 h，接種量為3%，搖瓶裝液量為75mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。在此條件下，A.cervinus ZJOU-AC1產(chǎn)殼聚糖酶活平均可達(dá)到8.26 U/mL，是之前（2.05 U/mL）的4.03倍。從可持續(xù)發(fā)展角度看，針對(duì)近幾年水產(chǎn)品加工企業(yè)以含大量殼聚糖為首的副產(chǎn)物（蝦殼、蟹殼等）日益增多所造成的環(huán)境問(wèn)題，這一生產(chǎn)工藝既能減少環(huán)境污染而且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，應(yīng)用前景廣泛。

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Optimization of fermentation conditions of chitosanase-producingAspergillus cervinus ZJOU-AC1 by response surface methodology

ZHANG Yemin1,SHAO Yifan1,XIONG Yanyan1,MAO Guizhu1,CHEN Xiaoe1*,FANG Xubo1,2,FU Pengcheng3
(1.College of Food and Medinel,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China;2.State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province,Zhoushan 316022,China;3.Zhoushan Haisheng Biotechnology Co.Ltd.,Zhoushan 316112,China)

Using chitosanase activity as the evaluation index,on the basis of single factor experiments,the fermentation conditions ofAspergillus cervinusZJOU-AC1 for chitosanase production were optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum fermentation conditions were obtained as followed:colloid chitosan 1.5%,ammonium sulfate 0.4%,monopotassium phosphate 0.2%,magnesium sulfate 0.05%,bran 2%,Tween-80 0.06%,fermentation time 96 h,fermentation temperature 30℃,initial pH value 5.9 and inoculum 3%.Under the optimum conditions, the average chitosanase activity was 8.26 U/ml,which was 4.03 times that of before optimization(2.05 U/ml).

chitosanase;Aspergillus cervinusZJOU-AC1;response surface methodology;optimization

Q815

0254-5071（2016）11-0093-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.019

2016-07-09

舟山市科技局項(xiàng)目（2015C41016）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目（2016R4 11033）

章曄敏（1995-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

*通訊作者：陳小娥（1968-），女，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊镔Y源綜合利用。