李江涌，王如福*，張懷敏，邢曉瑩，于迪，喬羽

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中030800）

山西老陳醋大曲中優(yōu)良乳酸菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究

李江涌，王如福*，張懷敏，邢曉瑩，于迪，喬羽

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中030800）

該研究以山西老陳醋大曲中分離篩選得到的1株優(yōu)良乳酸菌戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）為研究對(duì)象，以乳酸菌活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究培養(yǎng)條件（溫度、起始pH、接種量）對(duì)該菌株生長(zhǎng)繁殖的影響；并利用響應(yīng)面法對(duì)該菌株進(jìn)行高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，初始pH值6.67，接種量5.0%。在此條件下，乳酸菌活菌數(shù)為2.89×109CFU/mL。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，實(shí)際值與理論值基本相符。

大曲；戊糖片球菌；培養(yǎng)條件；響應(yīng)面法

山西老陳醋大曲以大麥和豌豆為原料經(jīng)過(guò)多道工序加工而成，大曲是一種天然的培養(yǎng)基，其中的微生物包括霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、芽孢細(xì)菌等[1]。大曲是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)，是山西老陳醋的物質(zhì)基礎(chǔ)、酶基礎(chǔ)和微生物基礎(chǔ)[2-4]。在山西老陳醋釀造過(guò)程中，乳酸菌能夠利用葡萄糖等碳源進(jìn)行同型或者異型乳酸發(fā)酵，并產(chǎn)生大量的乳酸及少量的甲酸、乙酸、丙酸等酸性末端產(chǎn)物，這些產(chǎn)物對(duì)其風(fēng)味的形成發(fā)揮著重要作用[5]。近年來(lái)，有關(guān)乳酸菌應(yīng)用于食醋釀造的研究大多數(shù)是在液體發(fā)酵過(guò)程中的應(yīng)用。趙春燕等[6]利用醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的協(xié)同發(fā)酵，有效減少了醋的刺激性酸味，且其酯香有所增加；蔣忠等[7]在液態(tài)深層法釀醋中加入乳酸菌和酵母菌，最終使得所釀醋不揮發(fā)酸和酯類含量分別提高了10.25倍和1.62倍，并且達(dá)到改善食醋感官品質(zhì)的目的。

乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)于山西老陳醋的重要作用表現(xiàn)在以下幾方面：乳酸菌發(fā)酵葡萄糖形成的乳酸減輕了醋酸刺激性氣味，使食醋的口感變得醇香柔和；乳酸菌產(chǎn)生的乳酸和部分醇類形成酯類物質(zhì)，增加食醋的酯香；乳酸菌除了可以通過(guò)自身的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝合成一些風(fēng)味物質(zhì)，其代謝中間產(chǎn)物丙酮酸還可作為其他眾多風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，賦予山西老陳醋濃郁的香味[8-9]；乳酸菌的活動(dòng)產(chǎn)生大量乳酸還可以降低釀造過(guò)程中酒醅及醋醅的pH值，抑制雜菌的生長(zhǎng)，保證食醋釀造的順利進(jìn)行。

響應(yīng)面分析（response surface analysis，RSA）方法是基于數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的緊密結(jié)合，它把回歸方法作為函數(shù)的估算工具，在多個(gè)因素試驗(yàn)中，用多項(xiàng)式將因素與響應(yīng)值的關(guān)系函數(shù)化，并且對(duì)影響因素的各因子水平和其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)[10-13]。該法可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，并且已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于培養(yǎng)基的優(yōu)化以及各類發(fā)酵條件的優(yōu)化中[14-19]。

本試驗(yàn)對(duì)分離自山西老陳醋大曲中的一株優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行人工培養(yǎng)，測(cè)定其生物學(xué)特性，采用單因素及正交試驗(yàn)探索其在人工環(huán)境下的最佳生長(zhǎng)條件，為規(guī)?；a(chǎn)乳酸菌制劑提供理論基礎(chǔ)，并為乳酸菌強(qiáng)化應(yīng)用于山西老陳醋發(fā)酵過(guò)程中，從而為提高山西老陳醋乳酸含量提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），編號(hào)為L(zhǎng)20，該菌株是本實(shí)驗(yàn)室從山西老陳醋大曲中分離、篩選，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、檸檬酸三胺2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1.0 L，121℃、20 min滅菌。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、檸檬酸三胺2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、瓊脂粉15.0 g、蒸餾水1.0 L，121℃、20 min滅菌。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-1ND型無(wú)菌超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾濱儀器設(shè)備有限公司；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：北京瑞科中儀科技有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊博特瑞儀器設(shè)備有限公司；MCS-3020全自動(dòng)高壓滅菌器：日本三洋集團(tuán)；722E可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；AR1140電子天平：上海皖衡電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，篩選最適培養(yǎng)方式、起始pH值、培養(yǎng)溫度及接種量，然后使用3因素3水平的響應(yīng)面分析法對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 菌株L20的活化與培養(yǎng)

將冷凍保藏的戊糖片球菌L20在室溫下解凍后，無(wú)菌條件下接種到MRS液體培養(yǎng)基中富集，再按1%（V/V）比例轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫條件下培養(yǎng)，重復(fù)3次以恢復(fù)菌株活力[20]。戊糖片球菌L20充分活化后，以接種量1%（V/V）接入MRS液體培養(yǎng)基，于30℃恒溫培養(yǎng)12 h得到種子液。

1.3.3 菌株L20生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采用比濁法原理測(cè)定戊糖片球菌L20的生長(zhǎng)曲線。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液，按1%接種量接種至滅菌的MRS液體培養(yǎng)基上，在30℃條件下培養(yǎng)，每間隔3 h取樣測(cè)定OD600nm值，并記錄數(shù)據(jù)，測(cè)定周期48 h，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，繪制菌株L20生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 乳酸菌數(shù)的測(cè)定

按照單因素試驗(yàn)要求，在不同培養(yǎng)方式、接種量、培養(yǎng)溫度、起始pH值下，將戊糖片球菌L20接種至滅菌的MRS液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 h后，取1 mL戊糖片球菌L20發(fā)酵液加入至9 mL無(wú)菌生理鹽水中，依次做10倍梯度稀釋液，選取2個(gè)適宜的連續(xù)稀釋倍數(shù)培養(yǎng)液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

（1）培養(yǎng)方式對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

選用MRS培養(yǎng)基，按1.0%的接種量以厭氧、有氧和靜置的培養(yǎng)方式分別在厭氧培養(yǎng)箱、恒溫振蕩水浴鍋和恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 h，培養(yǎng)溫度為30℃，每種培養(yǎng)方式3個(gè)重復(fù)，測(cè)定L20乳酸菌活菌數(shù)取平均值。

（2）培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，將1.0%接種量接入培養(yǎng)液，不同溫度下進(jìn)行乳酸菌的培養(yǎng)21 h，培養(yǎng)后測(cè)定其活菌數(shù)，確定菌株生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)溫度。

（3）培養(yǎng)基起始pH值對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉將MRS肉湯培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，培養(yǎng)過(guò)程中不再調(diào)pH值，其他各條件與培養(yǎng)方式測(cè)定相同，培養(yǎng)21 h后，測(cè)定不同起始pH值條件下該菌株活菌數(shù)，確定最佳起始pH。

（4）接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

將該乳酸菌株的接種量分別設(shè)定為1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、11.0%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基起始pH值為6.0，在培養(yǎng)溫度為30℃條件下培養(yǎng)21 h，培養(yǎng)后測(cè)定活菌數(shù)，確定最適接種量。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌的培養(yǎng)條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)溫度（A）、起始pH值（B）及接種量（C）為影響因素，以菌株L20活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，再采用3因素3水平的響應(yīng)面分析優(yōu)化菌株L20的培養(yǎng)條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Sigma plot 10.0軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；用Design Expert軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法及進(jìn)程對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行二次響應(yīng)面的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株L20在MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

以菌株L20培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制菌株L20的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株L20在MRS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of strain L20 in MRS medium

由圖1可知，菌株L20在0～6 h期間OD600nm值增長(zhǎng)緩慢，6～18 h菌株OD600nm值迅速增長(zhǎng)，21 h以后菌株的OD600nm值幾乎不變。這是由于菌體剛開(kāi)始（0～6 h）處于延滯期，是菌體對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)階段，菌體數(shù)量增長(zhǎng)緩慢；6～18 h時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期，菌體快速繁殖，菌體數(shù)量快速升高；到21 h進(jìn)入穩(wěn)定期；因此把菌株L20在MRS培養(yǎng)基中的穩(wěn)定期，即21 h作為最佳收獲期。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 培養(yǎng)方式對(duì)菌株L20生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，在MRS培養(yǎng)基中，菌株L20于30℃分別搖床培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速150 r/min）、靜置培養(yǎng)、厭氧培養(yǎng)，21 h后菌株L20的活菌數(shù)分別為2.03×108CFU/mL、2.55×109CFU/mL、2.60×109CFU/mL。其中，靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的活菌數(shù)均顯著高于搖床培養(yǎng)，而且菌株靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的活菌數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，培養(yǎng)方式對(duì)菌株L20的細(xì)胞生長(zhǎng)量影響很大，靜置培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)優(yōu)于振蕩好氧培養(yǎng)。本研究結(jié)果與蔡毅等[21]研究結(jié)果基本相符，因此，確定菌株L20采用靜置培養(yǎng)。

圖2 不同培養(yǎng)方式對(duì)菌株L20生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of cultivation methods on the growth of strain L20

2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)L20菌株生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，培養(yǎng)溫度為25℃、30℃、35℃時(shí)，菌株L20的活菌數(shù)較多，其中，30℃培養(yǎng)的活菌數(shù)略高于25℃和35℃培養(yǎng)的活菌數(shù)，但統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著；當(dāng)溫度達(dá)到40℃、45℃時(shí)，菌株L20的存活率顯著下降，說(shuō)明溫度過(guò)高會(huì)抑制菌株L20的生長(zhǎng)，但是該溫度下不會(huì)影響菌株L20的存活，表明該菌株能適應(yīng)山西老陳醋固態(tài)醋酸發(fā)酵的高溫環(huán)境（45℃左右）。結(jié)果表明，在30℃培養(yǎng)時(shí)，菌株L20活菌數(shù)達(dá)到最大值2.73×109CFU/mL，當(dāng)培養(yǎng)溫度過(guò)高時(shí)，酶的活性受到抑制，故培養(yǎng)溫度＞35℃時(shí)，菌株L20活菌數(shù)明顯降低。因此，菌株L20的最適培養(yǎng)溫度為30℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株L20生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of culture temperatureon the growth of strain L20

2.2.3 培養(yǎng)基起始pH對(duì)菌株L20生長(zhǎng)的影響

圖4 MRS培養(yǎng)基起始pH對(duì)菌株L20生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of initial pH of MRS medium on the growth of strain L20

由圖4可知，菌株L20分別在起始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0梯度系列的MRS培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)21 h后，菌株L20的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，菌株L20最適生長(zhǎng)的起始pH范圍為6.0左右。在起始pH值為6.0時(shí)培養(yǎng)菌株L20所得的活菌數(shù)顯著高于其他起始pH值組活菌數(shù)（P＜0.05），而且起始pH為6.0時(shí)，菌株L20活菌數(shù)最高為2.80×109CFU/mL。起始pH過(guò)低或過(guò)高（起始pH值為4或8時(shí)）會(huì)抑制菌株L20的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，起始pH值對(duì)L20乳酸菌活菌數(shù)生長(zhǎng)量影響很大。因此，最終確定菌株L20的最適起始pH值為6.0。

2.2.4 接種量對(duì)菌株L20生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，不同接種量培養(yǎng)后，菌株L20活菌數(shù)存在較大差異。菌株L20活菌數(shù)隨著接種量的升高，呈現(xiàn)先增加后減少的總趨勢(shì)，在接種量為3.0%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值2.81×109CFU/mL。因此，選擇3.0%接種量為宜。

圖5 接種量對(duì)L20生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of inoculum on the growth of strain L20

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)溫度（A）、起始pH值（B）及接種量（C）為影響因素，以菌株L20活菌數(shù)（Y）為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert.8.0.6的Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理，對(duì)菌株L20的培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)了3因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design Export 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多元回歸方程：Y=2.208×109-2.612×108A+7.888× 108B+2.750×107C+3.000×107AB-6.250×107AC-1.750× 107BC+1.710×108A2-1.112×109B2+1.385×108C2。對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

由表3可知，模型F值=29.00，P＜0.000 1，說(shuō)明該回歸方程是極顯著的。另外，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.322 4＞0.05），表明回歸方程具有顯著意義?；貧w模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.973 9，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合程度較好。能反應(yīng)97.39%的變化。故可以用該模型對(duì)菌株L20不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型數(shù)據(jù)顯示，一次項(xiàng)A、B及二次項(xiàng)B2影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB影響顯著（P＜0.05），但是，其他項(xiàng)對(duì)菌株L20的生長(zhǎng)不顯著（P＞0.05）。利用DesignExport8.0.6軟件得到各個(gè)因素的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25.00℃，起始pH值6.67，接種量5.0%，在該條件下獲得的菌株L20活菌數(shù)理論值為2.99×109CFU/mL。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析

為綜合考察交互項(xiàng)對(duì)菌株L20活菌數(shù)的影響，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程的等高線圖和響應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，培養(yǎng)溫度（A）和起始pH值（B）之間的交互作用對(duì)菌株L20活菌數(shù)具有顯著影響，其他因素之間的交互作用對(duì)菌株L20活菌數(shù)的影響不顯著。這一結(jié)果與回歸方程的交互項(xiàng)顯著性分析結(jié)果相符。

圖6 培養(yǎng)溫度、起始pH值及接種量對(duì)菌株L20活菌數(shù)影響的等高線和響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interactions between culture temperature,initial pH and inoculum on viable counts of strain L20

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證上述相應(yīng)面模型的有效性，以響應(yīng)面分析得到菌株L20最佳的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為25.00℃，起始pH值為6.67，接種量為5.0%，在該條件下獲得的菌株L20活菌數(shù)理論值為2.99×109CFU/mL。在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到該乳酸菌活菌數(shù)實(shí)際值為2.89×109CFU/mL稍低于理論值2.99×109CFU/mL，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株L20的培養(yǎng)條件是行之有效的。

3 結(jié)論

采用二次響應(yīng)面分析優(yōu)化后菌株L20的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25.00℃、起始pH值為6.67、接種量5.0%。在該條件下，獲得的活菌數(shù)實(shí)際值為2.89×109CFU/mL。為今后將該菌株強(qiáng)化于釀醋大曲或應(yīng)用于山西老陳醋釀造過(guò)程中的后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)和菌種培養(yǎng)條件信息。

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High density cultural conditions optimization of excellent lactic acid bacteria from Shanxi mature vinegar Daqu

LI Jiangyong,WANG Rufu*,ZHANG Huaimin,XING Xiaoying,YU Di,QIAO Yu
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Jinzhong 030800,China)

UsingPediococcus pentosaceus,an excellent lactic acid bacterium isolated fromDaquof Shanxi mature vinegar as research object,and lactic acid bacteria counts as evaluation index,the effects of temperature,initial pH,and inoculum on the viable counts were studied.High density culture condition ofP.pentosaceuswas optimized by response surface method,and the optimal conditions were as follows:culture temperature 25℃, initial pH 6.67 and inoculum 5.0%.Under these conditions,the count of lactic acid bacteria was 2.89×109CFU/ml.The verification tests results showed that the actual value was in accord with the theoretical value.

Daqu;Pediococcus pentosaceus;cultural conditions;response surface method

TS264.2

0254-5071（2016）11-0083-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.017

2016-08-21

山西省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目山西老陳醋產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)開(kāi)發(fā)與示范（2015-TN-10）

李江涌（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通訊作者：王如福（1960-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品工藝、果蔬采后生理及貯運(yùn)技術(shù)。