亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的誘變篩選及遺傳穩(wěn)定性研究

        2016-12-14 02:25:46辛國芹董佩佩汪祥燕趙影劉秀俠徐海燕谷巍
        中國釀造 2016年11期
        關(guān)鍵詞:葡萄糖氧化酶黑曲霉斜面

        辛國芹,董佩佩,汪祥燕,趙影,劉秀俠,徐海燕*,谷巍

        (山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東泰安271000)

        產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的誘變篩選及遺傳穩(wěn)定性研究

        辛國芹,董佩佩,汪祥燕,趙影,劉秀俠,徐海燕*,谷巍

        (山東寶來利來生物工程股份有限公司,山東泰安271000)

        采用平板顯色初篩、Underbofler滴定法復篩及紫外-硫酸二乙酯復合誘變的方法,從臨沂果園土樣中得到一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶(GOD)活性較好的菌株,命名為Bla-6,其產(chǎn)GOD酶活為(10.50±0.25)U/mL,與原始菌株LPA-4產(chǎn)GOD酶活(6.75 U/mL)相比提高了55.57%。結(jié)合5.8S rDNA-ITS區(qū)序列系統(tǒng)進化、菌落形態(tài)、生長特性、菌體形態(tài)等確定其分類地位。結(jié)果表明,所得菌株Bla-6被鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger),經(jīng)8代傳代培養(yǎng)后,GOD酶活維持在10.5 U/mL左右,該菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

        葡萄糖氧化酶;黑曲霉;誘變;遺傳穩(wěn)定性

        葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)是一種需氧脫氫酶,最早在黑曲霉(Aspergillus niger)提取物中發(fā)現(xiàn)[1]。GOD廣泛地分布于動物、植物和微生物體內(nèi),在有過氧化氫酶存在時,可專一性氧化葡糖糖成葡萄糖酸和過氧化氫。作為一種新型的綠色天然酶制劑,GOD在食品、工業(yè)、醫(yī)藥、養(yǎng)殖業(yè)、紡織漂染[2]和生物等領(lǐng)域應用十分廣泛[3-7]。GOD安全、無毒副作用,2013年農(nóng)業(yè)部將飼料級GOD生產(chǎn)菌株限定為青霉菌(Penicillium)和黑曲霉菌(Aspergillusniger)。國外對微生物發(fā)酵生產(chǎn)GOD酶制劑的發(fā)酵工藝研究將近30年,HATZINIKOLAOU D G等[8]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)GOD酶活多在2~7 U/mL,活性普遍較低,無法滿足生產(chǎn)需要。2002年,MIRON J等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過黑曲霉發(fā)酵菌株浸沒培養(yǎng)法可優(yōu)化生產(chǎn)GOD。目前,受技術(shù)水平、儀器設(shè)備等因素的限制,我國工業(yè)生產(chǎn)GOD酶制劑存在成本高、穩(wěn)定性及酶活性較差等問題。GOD應用廣泛,是一種很有潛力的生物催化劑,因此如何獲得高活性、高穩(wěn)定性、高產(chǎn)量的GOD,解決高成本、難純化等問題是當前研究的重點[10],隨著研究的不斷深入,GOD的應用前景會更加廣闊。如何更加經(jīng)濟有效地制備高純度、高酶活、高穩(wěn)定性的GOD是急需解決的問題。

        紫外誘變和化學誘變法篩選獲得GOD生產(chǎn)菌株是提高原始菌株產(chǎn)酶能力的有效方法。RAY S等[11]通過聚乙烯亞胺和紫外誘變處理黑曲霉孢子共得到1 976株突變株,其中黑曲霉AB1801產(chǎn)葡萄糖酸鈣達120 g/L。朱洪菊[12]以初始GOD酶活為1.21 U/mL的黑曲霉菌株為出發(fā)菌株,通過紫外誘變、微波誘變處理,最終篩選出了一株酶活達到5.32 U/mL的突變株C3。朱運平等[13]以黑曲霉為出發(fā)菌株,通過紫外誘變、亞硝酸鈉化學誘變及紫外-亞硝酸鈉復合誘變?nèi)N方法篩選得到一株高產(chǎn)胞外GOD的突變株,產(chǎn)GOD酶活力達186.32 U/mL,為原始菌株的3.8倍,且產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。此外,定向突變獲得高產(chǎn)GOD突變菌株的研究處于起步階段,發(fā)展?jié)摿艽?。HOLLAND J T等[14]將黑曲霉GOD基因132位的蘇氨酸定向突變成絲氨酸時,發(fā)現(xiàn)特異性常數(shù)kcat/Km升高較為顯著,同時對底物親和力僅降低3%。本研究從果園土壤中篩選產(chǎn)GOD的菌株,并采用紫外-硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)復合誘變篩選高產(chǎn)GOD的菌株,旨在為其應用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供一定的參考意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        從山東省臨沂市秋季桃園內(nèi)多點混合采集深度為0~10 cm的土樣。本試驗所選用的平板分離培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基詳見參考文獻[15]。硫代硫酸鈉(分析純):天津博迪化工股份有限公司;硫酸二乙酯(DES)(色譜純):上海譜振生物科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        SW-CJ-2F型超凈工作臺:江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司;HPX-9082MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DHZ-CA型大容量振蕩器:太倉市實驗設(shè)備廠;FA-1004型電子分析天平:上海太平儀器廠;LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠。

        1.3 方法

        1.3.1 產(chǎn)GOD菌株的初篩

        稱取10 g采集的土樣于帶有玻璃珠的100 mL生理鹽水中,振蕩培養(yǎng)30 min,吸取1 mL土樣上清液梯度稀釋,涂布于平板分離培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)3 d后觀察平板,將出現(xiàn)藍色圈的菌株接種到斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2 d至產(chǎn)生黑色孢子,而后進行復篩。

        1.3.2 產(chǎn)GOD菌株的復篩及GOD酶活測定

        將斜面培養(yǎng)基上菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30℃、180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)5 d,采用Underbofler滴定法[16]測定菌株產(chǎn)GOD酶活。

        GOD酶活:測定發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min得粗酶液。取250mL三角瓶,加入2%葡萄糖磷酸緩沖溶液25mL及1 mL粗酶液,立即置于30℃水浴振蕩1 h然后加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液終止反應,用0.1 mol/L HCl滴定剩余的NaOH,記錄所消耗的HCl體積為A,空白組(CK)用1 mL蒸餾水替代粗酶液,其他操作相同,記錄所消耗的HCl體積B,每個樣品測定3個平行,取均值計算酶活。

        GOD酶活=(B-A)×F×N×1 000/60

        式中:A為中和NaOH所消耗的HCl體積,mL;B為空白組中和NaOH所消耗的HCl體積,mL;F為粗酶液稀釋倍數(shù),N為HCl濃度,mol/L;1 000為單位換算系數(shù);60為反應時間,min。

        GOD酶活的定義:在上述實驗條件下每分鐘催化氧化1μmol/L的葡萄糖的酶量定義為一個酶活單位,以1μmol/min表示,即1 U/mL。

        1.3.3 產(chǎn)GOD菌株的紫外-硫酸二乙酯復合誘變

        將復篩菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)長滿孢子后,用適量的無菌生理鹽水洗脫斜面培養(yǎng)基上的孢子,置于三角瓶中,180 r/min振蕩20 min后用脫脂棉過濾菌絲從而得到分散的單孢子懸液,血球計數(shù)法計算孢子數(shù)。

        將孢子懸液均勻地鋪于已滅菌7cm表面皿中,制成1mm左右的薄層,于超凈工作臺的紫外燈下照射15 s后,進行梯度稀釋,稀釋度為10-1~10-6。取10-4~10-63個稀釋度的孢子懸液各0.2mL,涂布于斜面培養(yǎng)基平板上,30℃避光培養(yǎng)2~3 d。挑取平板上生長速度較快的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)至孢子產(chǎn)生,再通過發(fā)酵培養(yǎng)基測定菌株產(chǎn)GOD酶活。選取產(chǎn)酶活高的菌株進行保存。

        以紫外線誘變所得產(chǎn)GOD酶活最高的菌株為出發(fā)菌株,進行硫酸二乙酯誘變。取5 mL經(jīng)紫外線誘變的高產(chǎn)GOD酶活孢子懸液加入體積為25 mL的三角瓶中,再加入0.2 mL體積分數(shù)為50%的DES,振蕩40 min,再加入0.5 mL的硫代硫酸鈉(85%)終止反應。稀釋梯度為10-1~10-6。取10-4~10-63個稀釋度的孢子懸液各0.2 mL,涂布于斜面培養(yǎng)基平板上,30℃倒置培養(yǎng)2~3 d。挑取平板上生長速度較快的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)至孢子產(chǎn)生,再通過發(fā)酵培養(yǎng)基測定菌株產(chǎn)GOD酶活。選取產(chǎn)酶活高的菌株進行保存。

        1.3.4 產(chǎn)GOD菌株的鑒定

        采用5.8S rDNA-ITS區(qū)序列法對篩選到的產(chǎn)GOD酶性能較好的菌株進行鑒定,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。待測菌株培養(yǎng)3d后挑取菌至發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)2 d,然后將菌絲過濾烘干,采用生工生物工程(上海)股份有限公司真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取待測菌的基因組總DNA。

        采用引物ITS1與ITS4對5.8S rDNA-ITS區(qū)序列進行擴增,聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增反應體系及反應條件詳見參考文獻[15]。將PCR擴增產(chǎn)物送北京博尚公司測序,在美國國家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnologyinformation,NCBI)中進行基本的局部比對搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)比對分析,用DNAMAN 6.0軟件進行多重序列比較,用MEGA 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

        1.3.5 遺傳穩(wěn)定性測定

        將經(jīng)過紫外-硫酸二乙酯復合誘變篩選得到的產(chǎn)GOD酶活最高的菌株連續(xù)8代傳代培養(yǎng)后,觀察菌株的生長性能、菌落形態(tài),測定各代菌株產(chǎn)GOD酶活。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 土壤樣品中產(chǎn)GOD菌株的篩選

        對果園土壤樣品初步篩選分離得到16株產(chǎn)GOD的菌株,挑取初篩平板中藍色反應圈較大的6株菌至斜面培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)產(chǎn)生黑色孢子后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基進行復篩,30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后,采用Underbofler滴定法測定菌株產(chǎn)GOD酶活力,結(jié)果如表1所示。

        表1 分離菌株產(chǎn)GOD酶活測定結(jié)果Table 1 Determination results of GOD activity produced by isolated strains

        由表1可知,以菌株LPA-4產(chǎn)GOD酶活力最高,發(fā)酵5 d后發(fā)酵液中GOD酶活可達6.750U/mL,因此選定菌株LPA-4進行后續(xù)誘變試驗。

        2.2 誘變篩選結(jié)果

        2.2.1 紫外誘變篩選結(jié)果

        對土壤樣品中篩選得到菌株LPA-4進行紫外誘變,篩選得到8株菌進行發(fā)酵培養(yǎng),其GOD酶活測定結(jié)果如表2所示。

        表2 紫外誘變菌株產(chǎn)GOD酶活測定結(jié)果Table 2 Determination results of GOD activity produced by UV-light mutagenesis strains

        由表2可知,大部分菌株紫外誘變后與原始株LPA-4相比,產(chǎn)GOD性能無明顯提高,菌株編號為LPA4-7的產(chǎn)GOD酶活最高,為(7.550±0.283)U/mL,選定菌株LPA4-7孢子懸浮液進行DES誘變篩選。

        2.2.2 復合誘變篩選結(jié)果

        對菌株LPA4-7孢子懸浮液進行DES誘變,然后梯度稀釋涂布斜面培養(yǎng)基平板30℃培養(yǎng),挑取生長速度較快的8株菌至斜面保存,并將這8株菌接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃、180 r/min發(fā)酵5 d,檢測GOD酶活結(jié)果如表3所示。

        由表3可知,經(jīng)誘變后,酶活力較菌株LPA4-7提高的菌株有LPA47-3、LPA47-5、LPA47-8 3株,酶活分別比原始菌株LPA-4提高38.76%、55.57%、38.01%。誘變篩選的菌株LPA47-5酶活最高,相同條件下產(chǎn)酶性能在(10.501± 0.254)U/mL,將其命名為菌株Bla-6進行后續(xù)試驗。

        表3 復合誘變篩選結(jié)果Table 3 Screening results of compound mutagenesis

        2.3 誘變株Bla-6遺傳穩(wěn)定性

        誘變株進行8次傳代培養(yǎng),將誘變得到的高產(chǎn)菌株Bla-6連續(xù)轉(zhuǎn)接8代,每傳一代用搖瓶發(fā)酵液測定酶活,結(jié)果如表4所示。

        表4 誘變菌株Bla-6遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Genetic stability test results of mutant strain Bla-6

        誘變菌株存在遺傳性能不穩(wěn)定的風險,隨著傳代次數(shù)的增加產(chǎn)酶性能可能會有所減弱。由表4可知,誘變株Bla-6在1~8代范圍內(nèi)產(chǎn)GOD酶活較穩(wěn)定,維持在10.5 U/mL左右,說明誘變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

        2.4 誘變株Bla-6的鑒定

        2.4.1 誘變株Bla-6的生長特性

        將菌株Bla-6純培養(yǎng)物挑至平板分離培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落形態(tài)和在顯微鏡下菌株形態(tài),結(jié)果見圖1。由圖1可知,菌落生長較快,初白色,產(chǎn)孢后表面黑色,呈粉末狀。分生孢子頭呈球形或近球形,黑色放射狀,分生孢子梗長短不一,布滿整個頂囊,褐色球形。

        圖1 誘變菌株Bla-6的菌落特征(a)和菌株形態(tài)(b)Fig.1 Colony characteristics(a)and strain morphology(b)of mutant strain Bla-6

        2.4.2 PCR擴增結(jié)果

        利用引物ITS1和ITS4,菌株Bla-6的ITS區(qū)基因PCR擴增到目的片段,在500 bp左右有1條明顯的電泳條帶,如圖2所示。將擴增得到的PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

        圖2 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS區(qū)序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification product electrophoregram of 5.8 S rDNAITS sequence of strain Bla-6

        2.4.3 目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

        將目的菌株Bla-6的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列在NCBI中進行BLAST分析,并下載相似性最大的序列和該屬內(nèi)代表種,利用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)。

        圖3 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA ITS sequence of strain Bla-6

        由圖3可知,與GenBank數(shù)據(jù)庫中曲霉菌相關(guān)菌株的ITS區(qū)基因序列JF838357.1、HQ850370.1等的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列比較分析,發(fā)現(xiàn)其與曲霉屬(Aspergillussp.)的黑曲霉菌(Aspergillus niger)親緣關(guān)系最近,相似度達99%。綜合菌株的菌落形態(tài)、生長特性、鏡檢形態(tài)及5.8S rDNA-ITS區(qū)序列系統(tǒng)進化分析,確定菌株Bla-6為黑曲霉(Aspergillus niger)。

        3 結(jié)論

        本研究采用平板顯色法初篩和Underbofler滴定法進行復篩,從土壤樣品中得到8株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的菌株,通過紫外-硫酸二乙酯復合誘變篩選出一株產(chǎn)GOD酶活性能較好的誘變菌株Bla-6。經(jīng)過8代傳代培養(yǎng),誘變菌株Bla-6具有產(chǎn)GOD酶性能較好的遺傳穩(wěn)定性。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶具有在常溫常壓下完成,微生物容易培養(yǎng)、繁殖快,生產(chǎn)和設(shè)備投資較少,以及其設(shè)備泛用性較廣的優(yōu)點,故可在短時間內(nèi)廉價的大量生產(chǎn)。該產(chǎn)葡萄糖氧化酶突變株遺傳性狀穩(wěn)定,相同發(fā)酵條件下?lián)u瓶產(chǎn)酶可達(10.501±0.254)U/mL,比原始菌株LPA-4(6.750 U/mL)提高了55.57%。該研究對產(chǎn)GOD菌株的篩選誘變方法的建立和對菌株產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性的研究,為促進黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶工業(yè)化生產(chǎn),提高酶的應用質(zhì)量,降低生產(chǎn)成本提供了科學依據(jù)。

        [1]MULLER D.Oxidation von glukosemit extraktenausAspegillus niger[J]. Biochem Z,1928,199:136-170.

        [2]FAROOQ A,ALI S,ABBAS N,et al.Comparative performance evaluation of conventional bleaching and enzymatic bleaching with glucose oxidase on knitted cotton fabric[J].J Clean Prod,2013,42(3):167-171.

        [3]DEVARAJA G M,ANNAPUMA S S,RAO A,et al.Thermal inactivation of glucose oxidase:mechanism and stabilization using additives[J]. J Biol Chem,2003,278(27):24324-24333.

        [4]WHITTINGTON H,WILLIAMS S K,BIDGOOD K,et al.Expression of theAspergillus nigerglucose oxidase gene inA.niger,A.nidulansand Sacchanomyces cerevisiae[J].Curr Cenet,1991,18(6):531-536.

        [5]劉超,袁建國,王元,等.葡萄糖氧化酶的研究進展[J].食品與藥品,2010,7(12):286-289.

        [6]梅叢笑,方元超.葡萄糖氧化酶在食品及飲料中的應用[J].江蘇食品與發(fā)酵,2003,3(1):22-25.

        [7]李彤,姚子華.新型葡萄糖氧化酶電極用于臨床血糖的測定[J].分析測試學報,2004,23(3):67-69.

        [8]HATZINIKOLAOU D G,MACRIS B J.Factors regulating production of glucose oxidase byAspergillus niger[J].Enzyme Microb Tech,1995, 17(6):530-534.

        [9]MIRON J,GONZALEZ M P,PASTRANA L,et al.Murado diauxic production of glucose oxidase byAspergillus nigerin submerged culture[J]. Enzyme Microb Tech,2002,31(5):615-620.

        [10]周生民,趙偉.葡萄糖氧化酶活性變化的分析[J].中國釀造,2013,32(9):130-131.

        [11]RAY S,BNAIK A K.Effect of ammonium and nitrate ratio on glucose oxidase activity during gluconic acid fermentation by a mutant strain of Aspergillus niger[J].Indian J Exp Biol,1999,37(4):391-395.

        [12]朱洪菊.葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌的誘變育種及條件優(yōu)化[D].濟南:山東師范大學,2012.

        [13]朱運平,褚文丹,李秀婷,等.產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶菌株的分離鑒定及其誘變育種研究[J].中國食品學報,2014,14(4):96-103.

        [15]HOLLAND J T,HARPER J C,DOLAN P L,et al.Rational redesign of glucose oxidase for improved catalytic function and stability[J].PloS one,2012,7(6):e37924.

        [15]辛國芹,徐海燕,汪孟娟,等.高產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的分離鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].飼料廣角,2015(5):34-38.

        [16]張樹政.酶制劑工業(yè)(下冊)[M].北京:科學出版社,1984:558-591.

        Mutation screening and genetic stability of glucose oxidase-producing strain

        XIN Guoqin,DONG Peipei,WANG Xiangyan,ZHAO Ying,LIU Xiuxia,XU Haiyan*,GU Wei
        (Shandong Baolai-leelai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

        By preliminary screening of plate coloration,secondary screening of Underbofler titration method,a glucose oxidase-producing strain was obtained from Linyi orchard soil samples,and named as strain Bla-6.The glucose oxidase(GOD)activity produced by strain Bla-6 was(10.50±0.25) U/ml,which was 55.57%higher than that(6.75 U/ml)produced by original strain LPA-4.By the analysis of 5.8S rDNA-ITS gene sequence,colonial morphology,growth characteristics,and mycelial morphology,the results showed that the strain Bla-6 was identified asAspergillus niger.After subculture of 10 successive generations,the GOD activity maintained at about 10.5 U/ml,which showed that the strain had good genetic stability.

        glucose oxidase;Aspergillus niger;mutation;genetic stability

        Q939.97

        0254-5071(2016)11-0069-04

        10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.014

        2016-05-24

        國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃‘863計劃'子課題(2013AA102806)

        辛國芹(1985-),女,助理研究員,碩士,主要從事基礎(chǔ)微生態(tài)研究工作。

        *通訊作者:徐海燕(1975-),女,高級畜牧師,本科,主要從事微生態(tài)制劑研發(fā)工作。

        猜你喜歡
        葡萄糖氧化酶黑曲霉斜面
        斜面之上探動能
        巧用“相對”求解光滑斜面體問題
        巧用“相對”求解光滑斜面體問題
        葡萄糖氧化酶的研究進展及其在豬生產(chǎn)中的應用分析
        飼料博覽(2019年7期)2019-02-12 22:28:15
        齒輪狀SBA-15的制備及其對葡萄糖氧化酶的吸附行為研究
        陶瓷學報(2019年5期)2019-01-12 09:17:42
        葡萄糖氧化酶在斷奶仔豬日糧上的應用研究進展
        一題多變 搞定斜面上的運動
        復合誘變選育耐高溫高產(chǎn)葡萄糖酸鹽的黑曲霉菌株
        中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:22
        黑曲霉產(chǎn)纖維素酶混合發(fā)酵條件的研究
        中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:20
        酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
        欧美精品欧美人与动人物牲交 | 中文字幕精品久久天堂一区| 亚洲AV专区一专区二专区三 | 麻豆国产乱人伦精品一区二区| 看全色黄大黄大色免费久久| av天堂一区二区三区精品| 国产亚洲一本二本三道| 国产午夜激无码av毛片不卡 | 女人脱了内裤趴开腿让男躁| 国产亚洲精品aaaaaaa片 | 人人爽久久久噜人人看| 精品久久久久成人码免费动漫| 手机看片福利一区二区三区| 亚洲日韩v无码中文字幕| 波多野结衣一区二区三区视频| 日本a一区二区三区在线| 国产一区二区av免费观看| 无码aⅴ精品一区二区三区浪潮 | 人人妻人人爽人人澡欧美一区| 人人爽人人爱| 一本一本久久a久久精品综合| 欧美成人免费看片一区| 亚洲av精品一区二区| 自拍偷拍韩国三级视频| 少妇性l交大片7724com| 亚洲va国产va天堂va久久| 国产自国产在线观看免费观看| 中国女人a毛片免费全部播放| 精品国产亚洲av成人一区| 少妇又骚又多水的视频| 国产精品免费看久久久无码| 日产精品久久久久久久性色| 亚洲精品成AV无在线观看| 中文字幕高清一区二区 | 亚洲中文字幕精品乱码2021 | 日韩啪啪精品一区二区亚洲av| 日韩中文字幕无码av| 久久99精品久久只有精品| 国产精品内射久久一级二| 亚洲中文字幕在线第二页| 国产系列丝袜熟女精品视频|