辛國芹，董佩佩，汪祥燕，趙影，劉秀俠，徐海燕*，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的誘變篩選及遺傳穩(wěn)定性研究

辛國芹，董佩佩，汪祥燕，趙影，劉秀俠，徐海燕*，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

采用平板顯色初篩、Underbofler滴定法復篩及紫外-硫酸二乙酯復合誘變的方法，從臨沂果園土樣中得到一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶（GOD）活性較好的菌株，命名為Bla-6，其產(chǎn)GOD酶活為（10.50±0.25）U/mL，與原始菌株LPA-4產(chǎn)GOD酶活（6.75 U/mL）相比提高了55.57%。結(jié)合5.8S rDNA-ITS區(qū)序列系統(tǒng)進化、菌落形態(tài)、生長特性、菌體形態(tài)等確定其分類地位。結(jié)果表明，所得菌株Bla-6被鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger），經(jīng)8代傳代培養(yǎng)后，GOD酶活維持在10.5 U/mL左右，該菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

葡萄糖氧化酶；黑曲霉；誘變；遺傳穩(wěn)定性

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種需氧脫氫酶，最早在黑曲霉（Aspergillus niger）提取物中發(fā)現(xiàn)[1]。GOD廣泛地分布于動物、植物和微生物體內(nèi)，在有過氧化氫酶存在時，可專一性氧化葡糖糖成葡萄糖酸和過氧化氫。作為一種新型的綠色天然酶制劑，GOD在食品、工業(yè)、醫(yī)藥、養(yǎng)殖業(yè)、紡織漂染[2]和生物等領(lǐng)域應用十分廣泛[3-7]。GOD安全、無毒副作用，2013年農(nóng)業(yè)部將飼料級GOD生產(chǎn)菌株限定為青霉菌（Penicillium）和黑曲霉菌（Aspergillusniger）。國外對微生物發(fā)酵生產(chǎn)GOD酶制劑的發(fā)酵工藝研究將近30年，HATZINIKOLAOU D G等[8]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)GOD酶活多在2～7 U/mL，活性普遍較低，無法滿足生產(chǎn)需要。2002年，MIRON J等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過黑曲霉發(fā)酵菌株浸沒培養(yǎng)法可優(yōu)化生產(chǎn)GOD。目前，受技術(shù)水平、儀器設(shè)備等因素的限制，我國工業(yè)生產(chǎn)GOD酶制劑存在成本高、穩(wěn)定性及酶活性較差等問題。GOD應用廣泛，是一種很有潛力的生物催化劑，因此如何獲得高活性、高穩(wěn)定性、高產(chǎn)量的GOD，解決高成本、難純化等問題是當前研究的重點[10]，隨著研究的不斷深入，GOD的應用前景會更加廣闊。如何更加經(jīng)濟有效地制備高純度、高酶活、高穩(wěn)定性的GOD是急需解決的問題。

紫外誘變和化學誘變法篩選獲得GOD生產(chǎn)菌株是提高原始菌株產(chǎn)酶能力的有效方法。RAY S等[11]通過聚乙烯亞胺和紫外誘變處理黑曲霉孢子共得到1 976株突變株，其中黑曲霉AB1801產(chǎn)葡萄糖酸鈣達120 g/L。朱洪菊[12]以初始GOD酶活為1.21 U/mL的黑曲霉菌株為出發(fā)菌株，通過紫外誘變、微波誘變處理，最終篩選出了一株酶活達到5.32 U/mL的突變株C3。朱運平等[13]以黑曲霉為出發(fā)菌株，通過紫外誘變、亞硝酸鈉化學誘變及紫外-亞硝酸鈉復合誘變?nèi)N方法篩選得到一株高產(chǎn)胞外GOD的突變株，產(chǎn)GOD酶活力達186.32 U/mL，為原始菌株的3.8倍，且產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。此外，定向突變獲得高產(chǎn)GOD突變菌株的研究處于起步階段，發(fā)展?jié)摿艽?。HOLLAND J T等[14]將黑曲霉GOD基因132位的蘇氨酸定向突變成絲氨酸時，發(fā)現(xiàn)特異性常數(shù)kcat/Km升高較為顯著，同時對底物親和力僅降低3%。本研究從果園土壤中篩選產(chǎn)GOD的菌株，并采用紫外-硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）復合誘變篩選高產(chǎn)GOD的菌株，旨在為其應用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從山東省臨沂市秋季桃園內(nèi)多點混合采集深度為0～10 cm的土樣。本試驗所選用的平板分離培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基詳見參考文獻[15]。硫代硫酸鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；硫酸二乙酯（DES）（色譜純）：上海譜振生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型超凈工作臺：江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；HPX-9082MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHZ-CA型大容量振蕩器：太倉市實驗設(shè)備廠；FA-1004型電子分析天平：上海太平儀器廠；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)GOD菌株的初篩

稱取10 g采集的土樣于帶有玻璃珠的100 mL生理鹽水中，振蕩培養(yǎng)30 min，吸取1 mL土樣上清液梯度稀釋，涂布于平板分離培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3 d后觀察平板，將出現(xiàn)藍色圈的菌株接種到斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2 d至產(chǎn)生黑色孢子，而后進行復篩。

1.3.2 產(chǎn)GOD菌株的復篩及GOD酶活測定

將斜面培養(yǎng)基上菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)5 d，采用Underbofler滴定法[16]測定菌株產(chǎn)GOD酶活。

GOD酶活：測定發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min得粗酶液。取250mL三角瓶，加入2%葡萄糖磷酸緩沖溶液25mL及1 mL粗酶液，立即置于30℃水浴振蕩1 h然后加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液終止反應，用0.1 mol/L HCl滴定剩余的NaOH，記錄所消耗的HCl體積為A，空白組（CK）用1 mL蒸餾水替代粗酶液，其他操作相同，記錄所消耗的HCl體積B，每個樣品測定3個平行，取均值計算酶活。

GOD酶活=（B-A）×F×N×1 000/60

式中：A為中和NaOH所消耗的HCl體積，mL；B為空白組中和NaOH所消耗的HCl體積，mL；F為粗酶液稀釋倍數(shù)，N為HCl濃度，mol/L；1 000為單位換算系數(shù)；60為反應時間，min。

GOD酶活的定義：在上述實驗條件下每分鐘催化氧化1μmol/L的葡萄糖的酶量定義為一個酶活單位，以1μmol/min表示，即1 U/mL。

1.3.3 產(chǎn)GOD菌株的紫外-硫酸二乙酯復合誘變

將復篩菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)長滿孢子后，用適量的無菌生理鹽水洗脫斜面培養(yǎng)基上的孢子，置于三角瓶中，180 r/min振蕩20 min后用脫脂棉過濾菌絲從而得到分散的單孢子懸液，血球計數(shù)法計算孢子數(shù)。

將孢子懸液均勻地鋪于已滅菌7cm表面皿中，制成1mm左右的薄層，于超凈工作臺的紫外燈下照射15 s后，進行梯度稀釋，稀釋度為10-1～10-6。取10-4～10-63個稀釋度的孢子懸液各0.2mL，涂布于斜面培養(yǎng)基平板上，30℃避光培養(yǎng)2～3 d。挑取平板上生長速度較快的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)至孢子產(chǎn)生，再通過發(fā)酵培養(yǎng)基測定菌株產(chǎn)GOD酶活。選取產(chǎn)酶活高的菌株進行保存。

以紫外線誘變所得產(chǎn)GOD酶活最高的菌株為出發(fā)菌株，進行硫酸二乙酯誘變。取5 mL經(jīng)紫外線誘變的高產(chǎn)GOD酶活孢子懸液加入體積為25 mL的三角瓶中，再加入0.2 mL體積分數(shù)為50%的DES，振蕩40 min，再加入0.5 mL的硫代硫酸鈉（85%）終止反應。稀釋梯度為10-1～10-6。取10-4～10-63個稀釋度的孢子懸液各0.2 mL，涂布于斜面培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取平板上生長速度較快的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)至孢子產(chǎn)生，再通過發(fā)酵培養(yǎng)基測定菌株產(chǎn)GOD酶活。選取產(chǎn)酶活高的菌株進行保存。

1.3.4 產(chǎn)GOD菌株的鑒定

采用5.8S rDNA-ITS區(qū)序列法對篩選到的產(chǎn)GOD酶性能較好的菌株進行鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。待測菌株培養(yǎng)3d后挑取菌至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，然后將菌絲過濾烘干，采用生工生物工程（上海）股份有限公司真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取待測菌的基因組總DNA。

采用引物ITS1與ITS4對5.8S rDNA-ITS區(qū)序列進行擴增，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增反應體系及反應條件詳見參考文獻[15]。將PCR擴增產(chǎn)物送北京博尚公司測序，在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI）中進行基本的局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析，用DNAMAN 6.0軟件進行多重序列比較，用MEGA 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 遺傳穩(wěn)定性測定

將經(jīng)過紫外-硫酸二乙酯復合誘變篩選得到的產(chǎn)GOD酶活最高的菌株連續(xù)8代傳代培養(yǎng)后，觀察菌株的生長性能、菌落形態(tài)，測定各代菌株產(chǎn)GOD酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品中產(chǎn)GOD菌株的篩選

對果園土壤樣品初步篩選分離得到16株產(chǎn)GOD的菌株，挑取初篩平板中藍色反應圈較大的6株菌至斜面培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)產(chǎn)生黑色孢子后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基進行復篩，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后，采用Underbofler滴定法測定菌株產(chǎn)GOD酶活力，結(jié)果如表1所示。

表1 分離菌株產(chǎn)GOD酶活測定結(jié)果Table 1 Determination results of GOD activity produced by isolated strains

由表1可知，以菌株LPA-4產(chǎn)GOD酶活力最高，發(fā)酵5 d后發(fā)酵液中GOD酶活可達6.750U/mL，因此選定菌株LPA-4進行后續(xù)誘變試驗。

2.2 誘變篩選結(jié)果

2.2.1 紫外誘變篩選結(jié)果

對土壤樣品中篩選得到菌株LPA-4進行紫外誘變，篩選得到8株菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，其GOD酶活測定結(jié)果如表2所示。

表2 紫外誘變菌株產(chǎn)GOD酶活測定結(jié)果Table 2 Determination results of GOD activity produced by UV-light mutagenesis strains

由表2可知，大部分菌株紫外誘變后與原始株LPA-4相比，產(chǎn)GOD性能無明顯提高，菌株編號為LPA4-7的產(chǎn)GOD酶活最高，為（7.550±0.283）U/mL，選定菌株LPA4-7孢子懸浮液進行DES誘變篩選。

2.2.2 復合誘變篩選結(jié)果

對菌株LPA4-7孢子懸浮液進行DES誘變，然后梯度稀釋涂布斜面培養(yǎng)基平板30℃培養(yǎng)，挑取生長速度較快的8株菌至斜面保存，并將這8株菌接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180 r/min發(fā)酵5 d，檢測GOD酶活結(jié)果如表3所示。

由表3可知，經(jīng)誘變后，酶活力較菌株LPA4-7提高的菌株有LPA47-3、LPA47-5、LPA47-8 3株，酶活分別比原始菌株LPA-4提高38.76%、55.57%、38.01%。誘變篩選的菌株LPA47-5酶活最高，相同條件下產(chǎn)酶性能在（10.501± 0.254）U/mL，將其命名為菌株Bla-6進行后續(xù)試驗。

表3 復合誘變篩選結(jié)果Table 3 Screening results of compound mutagenesis

2.3 誘變株Bla-6遺傳穩(wěn)定性

誘變株進行8次傳代培養(yǎng)，將誘變得到的高產(chǎn)菌株Bla-6連續(xù)轉(zhuǎn)接8代，每傳一代用搖瓶發(fā)酵液測定酶活，結(jié)果如表4所示。

表4 誘變菌株Bla-6遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Genetic stability test results of mutant strain Bla-6

誘變菌株存在遺傳性能不穩(wěn)定的風險，隨著傳代次數(shù)的增加產(chǎn)酶性能可能會有所減弱。由表4可知，誘變株Bla-6在1～8代范圍內(nèi)產(chǎn)GOD酶活較穩(wěn)定，維持在10.5 U/mL左右，說明誘變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 誘變株Bla-6的鑒定

2.4.1 誘變株Bla-6的生長特性

將菌株Bla-6純培養(yǎng)物挑至平板分離培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)和在顯微鏡下菌株形態(tài)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌落生長較快，初白色，產(chǎn)孢后表面黑色，呈粉末狀。分生孢子頭呈球形或近球形，黑色放射狀，分生孢子梗長短不一，布滿整個頂囊，褐色球形。

圖1 誘變菌株Bla-6的菌落特征(a)和菌株形態(tài)(b)Fig.1 Colony characteristics(a)and strain morphology(b)of mutant strain Bla-6

2.4.2 PCR擴增結(jié)果

利用引物ITS1和ITS4，菌株Bla-6的ITS區(qū)基因PCR擴增到目的片段，在500 bp左右有1條明顯的電泳條帶，如圖2所示。將擴增得到的PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

圖2 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS區(qū)序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification product electrophoregram of 5.8 S rDNAITS sequence of strain Bla-6

2.4.3 目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

將目的菌株Bla-6的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列在NCBI中進行BLAST分析，并下載相似性最大的序列和該屬內(nèi)代表種，利用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3）。

圖3 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA ITS sequence of strain Bla-6

由圖3可知，與GenBank數(shù)據(jù)庫中曲霉菌相關(guān)菌株的ITS區(qū)基因序列JF838357.1、HQ850370.1等的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列比較分析，發(fā)現(xiàn)其與曲霉屬（Aspergillussp.）的黑曲霉菌（Aspergillus niger）親緣關(guān)系最近，相似度達99%。綜合菌株的菌落形態(tài)、生長特性、鏡檢形態(tài)及5.8S rDNA-ITS區(qū)序列系統(tǒng)進化分析，確定菌株Bla-6為黑曲霉（Aspergillus niger）。

3 結(jié)論

本研究采用平板顯色法初篩和Underbofler滴定法進行復篩，從土壤樣品中得到8株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的菌株，通過紫外-硫酸二乙酯復合誘變篩選出一株產(chǎn)GOD酶活性能較好的誘變菌株Bla-6。經(jīng)過8代傳代培養(yǎng)，誘變菌株Bla-6具有產(chǎn)GOD酶性能較好的遺傳穩(wěn)定性。采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶具有在常溫常壓下完成，微生物容易培養(yǎng)、繁殖快，生產(chǎn)和設(shè)備投資較少，以及其設(shè)備泛用性較廣的優(yōu)點，故可在短時間內(nèi)廉價的大量生產(chǎn)。該產(chǎn)葡萄糖氧化酶突變株遺傳性狀穩(wěn)定，相同發(fā)酵條件下?lián)u瓶產(chǎn)酶可達（10.501±0.254）U/mL，比原始菌株LPA-4（6.750 U/mL）提高了55.57%。該研究對產(chǎn)GOD菌株的篩選誘變方法的建立和對菌株產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性的研究，為促進黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶工業(yè)化生產(chǎn)，提高酶的應用質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本提供了科學依據(jù)。

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Mutation screening and genetic stability of glucose oxidase-producing strain

XIN Guoqin,DONG Peipei,WANG Xiangyan,ZHAO Ying,LIU Xiuxia,XU Haiyan*,GU Wei
(Shandong Baolai-leelai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

By preliminary screening of plate coloration,secondary screening of Underbofler titration method,a glucose oxidase-producing strain was obtained from Linyi orchard soil samples,and named as strain Bla-6.The glucose oxidase(GOD)activity produced by strain Bla-6 was(10.50±0.25) U/ml,which was 55.57%higher than that(6.75 U/ml)produced by original strain LPA-4.By the analysis of 5.8S rDNA-ITS gene sequence,colonial morphology,growth characteristics,and mycelial morphology,the results showed that the strain Bla-6 was identified asAspergillus niger.After subculture of 10 successive generations,the GOD activity maintained at about 10.5 U/ml,which showed that the strain had good genetic stability.

glucose oxidase;Aspergillus niger;mutation;genetic stability

Q939.97

0254-5071（2016）11-0069-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.014

2016-05-24

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃‘863計劃'子課題（2013AA102806）

辛國芹（1985-），女，助理研究員，碩士，主要從事基礎(chǔ)微生態(tài)研究工作。

*通訊作者：徐海燕（1975-），女，高級畜牧師，本科，主要從事微生態(tài)制劑研發(fā)工作。