吳楠，雙全

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

ACE抑制肽的制備及其結(jié)構(gòu)對活性的影響

吳楠，雙全*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）通過一系列的生理反應，從而起到升高血壓的作用，在人體中過量ACE的產(chǎn)生會引起高血壓，而生物活性物質(zhì)ACE抑制肽能夠抑制ACE的功能。文章主要綜述了ACE抑制肽的主要制備方法及氨基酸序列特點與ACE抑制活性的關(guān)系，并闡述了脯氨酸對ACE抑制活性的影響，以及部分氨基酸的結(jié)構(gòu)特點及功能，為今后ACE抑制肽的制備與應用提供參考依據(jù)。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；抑制肽；脯氨酸；半抑制濃度

隨著生活水平的不斷提高，由飲食帶來的各種疾病層出不窮（如高血壓、高血脂、肥胖癥、糖尿病、癌癥等）。大眾的飲食理念已從吃飽向防治疾病方向轉(zhuǎn)變，以追求更健康的飲食習慣。生物活性肽（bioactive peptides，BAP）的分子質(zhì)量較?。ㄒ话悖? ku），與普通蛋白質(zhì)相比更易吸收，同時具有抗血栓、抗癌、抑菌、抗氧化、抗病毒、降低膽固醇以及抗高血壓等作用，已成為21世紀研究的新寵[1]。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種膜結(jié)合的糖蛋白，是一種多功能酶，在細胞膜上通過錨序列結(jié)合，分子質(zhì)量為13 000～15 000 u，最適pH值為7.5～8.3。正常人體內(nèi)ACE的含量處于平衡狀態(tài)，一旦平衡失調(diào)或ACE的含量增多就會導致高血壓疾病的發(fā)生。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽（angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEI）作為一種生物活性肽，具有降血壓的作用。如今化學合成的ACE抑制劑有很多，如賴洛普利、卡托普利、依那普利、雷米普拉等，對治療高血壓方面有很好的效果，但也會帶來很多毒副反應；而食源性ACE抑制肽（乳類、魚類、豆類等）與化學合成的ACE抑制肽不同，食用安全且具有保健和營養(yǎng)等功能，近幾年來成為國內(nèi)外研究的熱點，同時還是功能性產(chǎn)品的一個開發(fā)方向。根據(jù)國內(nèi)外對ACE抑制肽的研究顯示，其氨基酸序列的組成對其生物學功能具有一定的影響，如肽段中脯氨酸的存在位置影響ACE抑制肽的抑制活性、肽段中酪氨酸的存在可以增強肽段的抗氧化活性以及ACE抑制肽C-端和N-端上不同種類的氨基酸對ACE抑制肽活性有不同的影響。本文主要探討具有降血壓作用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽[2]的主要的制備方法、結(jié)構(gòu)特點及應用，進而發(fā)現(xiàn)氨基酸序列的排列方式及單個氨基酸所處位置對ACE抑制肽活性的影響，為今后更好地開發(fā)和利用ACE抑制肽提供理論的支持。

1 ACE抑制肽來源及其作用機制

ACE抑制肽的探索和研究開始于1965年，F(xiàn)ERREIRA S H[3]從南美蝮蛇毒液中首次分離提取出有緩激肽增強因子（bradykinin potentiating factors，BPF）的多肽類物質(zhì)，而這種多肽物質(zhì)對ACE的活性有抑制作用，這種多肽的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了學者們對肽類降壓藥的研究興趣。1971年，ONIDETTI M A等[4]提出了ACE抑制肽的初始模型，同時合成了應用于臨床的ACE抑制肽—壬肽抗壓素（teprotide），它是緩激肽增強因子（bradykinin-potentiating factor，BPFS）的成分之一。1977年，ONIDETTI M A等[5]提出了ACE與底物的作用模型并進行了后續(xù)的模型改善，根據(jù)這種改善后的模型合成了多種ACE抑制劑，但這些抑制劑通常會產(chǎn)生各種副作用。而其后，學者們將注意力轉(zhuǎn)向了食品領域，以求尋找更安全、更有效、無副作用的降血壓物質(zhì)。1979年，OSHIMA G等[6]采用細菌性膠原酶水解明膠分離了6條ACE抑制肽，這也是人類首次利用食源性蛋白質(zhì)為底物水解得到的ACE抑制肽。而其后，人們又從乳酪蛋白[7]、乳清蛋白[8]、乳酸菌發(fā)酵乳[9]、海洋生物蛋白[10-12]、大豆蛋白[13]、大麥蛋白[14]、大麻蛋白等[15]中發(fā)現(xiàn)了ACE抑制肽，并對其序列或結(jié)構(gòu)進行研究，目前采用最多的是從牛奶中提取的ACE抑制肽。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）是一種膜結(jié)合的的二肽羧基酶，是一種糖蛋白，人體組織及血漿中存在廣泛，在肺部的含量最多。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是近年來發(fā)現(xiàn)的人ACE的同系化合物，主要存在于腎臟和血管內(nèi)皮細胞中。人體中的ACE具有兩種亞型：分別是體細胞ACE（somatic ACE，sACE）和睪丸ACE（testicular ACE，tACE）。ACE是一種多功能酶，參與體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kininsystem，KKS）來影響機體血壓。RAS系統(tǒng)和KKS系統(tǒng)有相互拮抗的作用，是否平衡關(guān)系到血壓是否正常，ACE通過RAS和KKS來調(diào)節(jié)血壓[16]。在ACE的催化作用下血管緊張素I（angiotensin，AngI）轉(zhuǎn)化為一種有效的血管收縮劑血管緊張素II（angiotensin，AngII），AngII是目前發(fā)現(xiàn)的最強的血管收縮劑之一，其具體在體內(nèi)的作用關(guān)系如圖1所示。

圖1 ACE降壓作用機制Fig.1 Antihypertensive mechanism of ACE

2 ACE抑制肽的制備方法

2.1 直接酶解法

酶解法一般通過選擇合適的酶水解蛋白質(zhì)或多肽的方法，把具有ACE抑制活性的片段釋放出來，從而達到制備ACE抑制肽的目的。目前，酶水解法是提取ACE抑制肽普遍采用的方法，對乳蛋白采用酶水解法提取ACE抑制肽是研究最多的。酶水解法提取的ACE抑制肽無副作用，安全性高，在溫和條件下水解分裂產(chǎn)生ACE抑制肽，水解過程易于控制，且酶法生成的ACE抑制肽片段分子質(zhì)量小。

酶解法可分為兩類，即單一酶的一步反應和復合酶對底物的同時一步水解或按順序水解的多步反應。ACE抑制肽的功能與其氨基酸序列直接相關(guān)，ACE抑制肽的一級結(jié)構(gòu)或氨基酸潛在的影響其抑制活性，即影響其生物學功能，所以酶對底物的不同的酶解位點也是制備ACE抑制肽的關(guān)鍵。研究表明，2～7個氨基酸殘基組成的多肽更易被人體吸收并發(fā)揮其生物功能[17]，故采用復合酶解法或分部酶解法來制備分子質(zhì)量小而活性高的ACE抑制肽成為如今的研究熱點。

很多食品源的蛋白質(zhì)如乳蛋白、魚蛋白、植物蛋白等中都含有ACE抑制肽，由于食源蛋白中的ACE抑制肽在進入人體后在胃中就有大部分被分解，而食源蛋白中的ACE抑制肽的活性遠遠低于其在體外的活性，所以在普通條件下一般不具備降血壓的作用，而如果ACE抑制肽在體內(nèi)有較高的抑制活性，就會很好的發(fā)揮其作用。這些潛在的具有降血壓的功能的蛋白質(zhì)，之所以具有ACE的抑制活性是因為其含有降血壓功能的肽段。目前，制備ACE抑制肽常用的蛋白酶有兩種，分別是動物來源蛋白酶和植物來源蛋白酶，動物來源的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，植物來源的有小麥蛋白酶、木瓜蛋白酶[18]、生姜蛋白酶[15]、菠蘿蛋白酶[18]等。除此之外也有其它的蛋白酶，如：米曲霉蛋白酶[19]、黑曲霉脯氨酰胞內(nèi)蛋白酶[20]、風味酶蛋白酶、堿性蛋白酶等。經(jīng)研究證明，不同蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性具有顯著差異，其關(guān)鍵在于不同底物與不同蛋白酶的切合性。于曉慶等[21]以耗牛乳為原料，分別用4種蛋白酶（蛋白酶A、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶）進行水解制備ACE抑制肽，蛋白酶A是制備乳源ACE抑制肽的最佳水解酶，它的半抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）值為1.206 3 mg/mL，最佳反應條件為溫度52℃、pH 7、酶用量3%、底物質(zhì)量分數(shù)4.5%、水解9.5 h，酶解過程中隨著時間的延長，水解度略有所增加，同時游離氨基酸大幅增加。酶解法制備ACE抑制肽的過程中，通過改變酶的種類、酶的水解參數(shù)等條件，以達到制備具有較高抑制活性的降血壓肽的目的。

2.2 發(fā)酵法

發(fā)酵法又稱為間接酶解法，利用微生物體內(nèi)酶解反應制備ACE抑制肽。據(jù)研究表明，現(xiàn)如今研究的最多的是乳酸菌，發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）有較強的蛋白水解活性。YAMAMOTO N等[22]在1993年對瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）CP790進行研究發(fā)現(xiàn)，其分泌的蛋白水解酶水解酪蛋白后可以產(chǎn)生多種降血壓肽。NAKAMURA A等[23-24]用瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為發(fā)酵劑制作的一種乳酸菌飲料“Calpis”，對自發(fā)性高血壓（spontaneouslyhypertensive rats，SHR）大鼠長期飼喂后發(fā)現(xiàn)可抑制血壓的上升，并從“Calpis”中提取出了具有ACE抑制活性的短肽纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸（Val-Pro-Pro，VPP）和異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（Ile-Pro-Pro，IPP），經(jīng)國內(nèi)外多個學者驗證VPP和IPP具有顯著的降血壓效果。PAND等[25]采用Lactobacillus helveticusLB10菌種進行酸奶發(fā)酵，研究最佳發(fā)酵條件下得到的發(fā)酵產(chǎn)物具有最高ACE的抑制活性，所以通過實驗測定，最佳發(fā)酵條件是溫度39.0℃、pH 7.5、培養(yǎng)液4%，ACE的抑制率為75.46%。

發(fā)酵法是一種安全便捷的制備ACE抑制肽的方法，現(xiàn)今國內(nèi)外對發(fā)酵法制備ACE抑制肽的研究也較多，發(fā)酵法可通過改變發(fā)酵條件，使底物和酶都達到最佳反應條件以求得到具有最高ACE抑制活性的ACE抑制肽。

3 ACE抑制肽結(jié)構(gòu)對抑制活性的影響

3.1 ACE抑制肽活性與分子質(zhì)量的關(guān)系

根據(jù)許多研究表明，通過3 ku或更低的分子質(zhì)量的薄膜過濾的ACE抑制肽其抑制活性在增加。因此，不管蛋白底物的來源是什么，在一種蛋白水解產(chǎn)物中低分子質(zhì)量的多肽普遍具有更高效的活性。降血壓肽的長度一般為2～12個氨基酸殘基組成，個別多肽含有27個以上的氨基酸殘基，但2～7個氨基酸殘基的ACE抑制肽的抑制活性較高。吳暉等[26]在首次用堿性蛋白酶（alcalase）酶解絲素蛋白制備抑制活性高的降血壓肽，實驗測得ACE抑制率為74.07%，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（matrix-asissted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDL-TOF-MS）分析表明，得到的短肽分子質(zhì)量＜2.4u。代永剛等[27]用堿性蛋白酶酶解制備ACE抑制肽，用超濾進行初步分離，ACE的抑制率為57.34%，經(jīng)凝膠柱純化的ACE抑制率為62.78%，相對分子質(zhì)量＜1500u。MARQUESC等[28]用乳清蛋白水解液飼喂自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR），采用自動測量傳導技術(shù)給大鼠測量血壓，結(jié)果表明，乳清水解液中分子質(zhì)量在1～3 u之間組分具有降血壓的作用。CHEN J等[29]建立了有效的分離體系，使大米蛋白源的ACE抑制肽分離，經(jīng)過超濾等一系列步驟后的得到的ACE抑制肽的分子質(zhì)量＜3 u，且具有較好的抑制活性。崔楠[30]在研究木瓜蛋白酶酶解制備黃粉蟲ACE抑制肽中，采用超濾和葡聚糖G-15凝膠對酶水解產(chǎn)物分離，得到分子質(zhì)量不同的組分如下：分子質(zhì)量＞30 u、分子質(zhì)量10～30 u、分子質(zhì)量5～10 u、分子質(zhì)量3～5 u、分子質(zhì)量＜3 u，經(jīng)過對各組分進行檢測，分子質(zhì)量＜3 u的ACE抑制率高達65.43%，再經(jīng)過進一步的分離和純化ACE抑制率提高到72.11%。

3.2 ACE抑制肽活性與氨基酸序列脯氨酸末端的關(guān)系

目前，對ACE抑制肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系還沒有研究透徹，但國內(nèi)外的研究普遍認為，ACE抑制肽的活性與其自身的結(jié)構(gòu)和氨基酸順序有關(guān)。經(jīng)研究表明體細胞ACE的C端催化部位有三個催化結(jié)合位點，這三個位點分別與血管緊張素I（ACE-I）的三個疏水性殘基苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）對應。研究發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽的C端氨基酸為脯氨酸的抑制肽活性較高。脯氨酸（Pro）的化學名稱是吡咯烷酮羧酸，是一種環(huán)裝亞氨基酸。脯氨酸（Pro）是人體的非必需氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是組成人體蛋白質(zhì)的21種氨基酸之一。

NORRIS R等[20]用黑曲霉（Aspergillus niger）產(chǎn)的脯氨酰胞內(nèi)蛋白酶（prolyl endoproteinase，PEP）簡稱為An-PEP，對牛乳中αS-酪蛋白酶解得到的ACE抑制肽進行研究，通過分析確認An-PEP主要分裂蛋白質(zhì)C末端并且確認An-PEP具有把C末端分裂成丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、精氨酸（Arg）和組氨酸（His）的作用，證明有效ACE抑制肽的釋放是An-PEP特異性的作用，同時末端為脯氨酸的肽端抑制活性較高。同時在實驗過程中，水解物在Corolase PP蛋白酶的作用下的水解度為（11.27±0.61）%，1C50為（96.7±22.7）%，結(jié)果表明Corolase PP蛋白酶對水解物中的ACE抑制活性沒有太大的作用，但Corolase PP蛋白酶作用后ACE的抑制活性的穩(wěn)定性增強是由于ACE抑制肽的進一步降解使新的活性多肽釋放，同時ACE抑制活性保持平衡，這證明了含有大量脯氨酸的ACE抑制肽中包含有免受于胃部體內(nèi)的降解物。據(jù)報道低分子量且含有脯氨酸的多肽也許對機體內(nèi)消化酶有抵抗作用。QUIROS A等[31]也對包含脯氨酸的酪蛋白多肽中的ACE抑制活性在酶解作用后的穩(wěn)定性進行評估得知，含有兩個脯氨酸的多肽Leu-His-Leu-Pro-Leu-Pro對胃蛋白酶和Corolase PP的水解有較好的抵抗作用，其穩(wěn)定性是由于多肽序列的特異性。這可能說明脯氨酸在ACE抑制肽中起著關(guān)鍵作用。

黃國棟[32]對以脯氨酸為端基的ACE抑制三肽定量構(gòu)效關(guān)系進行研究表明，ACE抑制三肽的第一位和第三位對抑制活性的影響較大，中間的對抑制活性的影響較小，末端為脯氨酸的ACE抑制肽更易于與ACE結(jié)合。

3.3 美拉德反應對ACE抑制肽的影響

美拉德反應是羰基化合物和氨基化合物之間發(fā)生的一系列的復雜反應，從而改善食品的口感、色澤、香氣等特性。近年來作為一種改性手段，美拉德反應在食品中用來提高反應物的生物活性，如抗菌性、抗氧化活性、抗敏性、蘋果多酚氧化酶抑制活性、葡萄糖苷酶抑制活性等。美拉德反應主要有干法和濕法兩種，其中采用濕法來提高其生物活性的較廣泛。

RUFIáN-HENARES J A等[33]通過制備8種葡萄糖美拉德反應體系，對終產(chǎn)物得到的類黑精進行研究得知，類黑精具有較高的體外ACE抑制活性。洪旭[34]通過對酪蛋白進行兩部酶解、分離純化、氨基酸序列測定得到了4條ACE抑制活性較高的肽段，然后再用美拉德反應改性后其ACE抑制活性顯著提高，最后對改性后的產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的分析得出，濕法與干法美拉德反應相比，濕法的產(chǎn)物顏色深，羰氨縮合產(chǎn)物比例較大，反應程度高，且產(chǎn)物具有耐熱、耐酸堿、耐胃腸道消化等特點。

美拉德反應過程中羰氮縮合反應導致體系中C=O含量減少，C-N、N-H鍵含量升高，美拉德反應是一個級聯(lián)反應，多肽中有精氨酸、酪氨酸、賴氨酸與糖分子之間發(fā)生羰氮縮合反應，導致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而提高ACE抑制活性。因此，可以推斷ACE的抑制活性與其結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。

4 ACE抑制肽的應用

4.1 食品中的應用

ACE抑制肽具有降血壓的作用，可用于生產(chǎn)具有降血壓功能的保健品。最常用的就是發(fā)酵乳制品，利用乳酸菌發(fā)酵可以得到具有ACE的抑制活性的產(chǎn)物，通過優(yōu)化發(fā)酵條件來獲得更高ACE抑制活性的發(fā)酵乳。最為人所知的是已在日本上市的由乳酸桿菌發(fā)酵的脫脂牛奶“Calpis”，這種酸奶具有明顯的降血壓作用。

4.2 臨床應用

從ACE抑制肽的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，大量的醫(yī)學臨床研究證明了ACE抑制劑用來治療各種疾病的價值。ACE抑制劑可以改善血管內(nèi)壁的功能，增加心肌的血量，降低梗死面積，減少心率衰竭的發(fā)生。ACE抑制劑能夠提高患者對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗，還具有保護腎臟的作用。ACE抑制劑具有預防和治療心力衰竭和維護心肌的功能。ACE抑制劑將廣泛應用于高血壓、冠心病、心肌梗死、心力衰竭等疾病的治療和預防。

經(jīng)GADELHA A等[35]研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性與精神分裂癥患者的認知程度有關(guān)，在普通人與患者的測試中具有高ACE活性的患者記憶力差，通過對小鼠的動物試驗得知ACE基因的負載調(diào)節(jié)與小鼠的認知能力有關(guān)。因此，ACE抑制肽的研究對疾病的治療有一定的推動性作用。

5 結(jié)論

現(xiàn)如今對ACE抑制肽的研究較廣泛，但是仍然對其結(jié)構(gòu)與功能有疑惑。具有芳香性氨基酸和脯氨酸的ACE抑制肽，其ACE抑制活性都較高，這可能歸因于它們都是疏水性氨基酸且脯氨酸與芳香性氨基酸相似都具有環(huán)裝結(jié)構(gòu)。這些特征可能會影響其自身的穩(wěn)定性和對ACE的抑制能力。

今后的研究可致力于ACE抑制肽的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)本身會影響蛋白的生物學功能。通過對ACE抑制肽結(jié)構(gòu)的研究，尋找一個在人體中可以穩(wěn)定存在的抑制肽，使其進入人體后依舊保持高的ACE抑制活性。所以對ACE抑制肽結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究將有一個廣闊的前景。

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Preparation of ACE inhibitory peptides and effect of their structures on ACE activity

WU Nan,SHUANG quan*
(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

Angiotensin converting enzyme(ACE)plays an important physiologic role in the blood pressure regulation.The generation of excessive ACE in the human body could lead to high blood pressure,and the bioactive substances ACE inhibitory peptides could inhibit function of ACE.The main preparation methods of ACE inhibitory peptides and the relationship of amino acid sequence characteristics and ACE inhibitory activity were mainly summarized.The effect of proline on ACE inhibitory activity and the structure features and functions of some amino acids were elaborated, which provided reference for preparation and application of ACE inhibitory peptides.

angiotensin converting enzyme;inhibitory peptide;proline;IC50

TQ464.7

0254-5071（2016）11-0054-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.011

2016-07-11

國家自然科學基金（31460443）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金（2016MS0338）

吳楠（1993-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。

*通訊作者：雙全（1964-），男，教授，博士，研究方向為食品科學。