張雙燕，廖永紅，紀(jì)南，周曉宏*

（1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京100048）

基于高通量測(cè)序技術(shù)分析北京清香型大曲微生物多樣性

張雙燕1，廖永紅2，紀(jì)南2，周曉宏1*

（1.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京100048）

利用高通量測(cè)序方法對(duì)北京某清香型酒廠大曲細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析其微生物多樣性，并對(duì)大曲微生物在不同分類水平相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：大曲中在細(xì)菌操作分類單元(OTU)為47、真菌OTU為11，細(xì)菌種類較真菌種類豐富；細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)菌是乳酸菌，包括乳桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬四個(gè)屬。同時(shí)也檢測(cè)到醋桿菌屬、芽孢桿菌屬等；真菌中優(yōu)勢(shì)菌是假絲酵母屬，此外還有曲霉屬、毛霉屬、威克漢姆酵母屬等；對(duì)大曲物種Alpha多樣性分析表明測(cè)序深度基本覆蓋該酒曲中微生物種類；最后分析討論了大曲優(yōu)勢(shì)微生物在白酒釀造中的功能。該研究對(duì)于指導(dǎo)白酒生產(chǎn)具有重要意義。

清香型大曲；高通量測(cè)序；微生物；16S rDNA V4；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

我國(guó)白酒歷史悠久，是世界七大蒸餾酒之一。中國(guó)白酒傳統(tǒng)生產(chǎn)方式是固態(tài)發(fā)酵，用曲釀酒是我國(guó)白酒生產(chǎn)的特色，在世界釀酒史上獨(dú)樹(shù)一幟。日本學(xué)者板口謹(jǐn)一郎先生認(rèn)為，中國(guó)創(chuàng)造酒曲釀酒，是我國(guó)勞動(dòng)人民智慧的結(jié)晶，其重要性可與中國(guó)四大發(fā)明媲美[1-2]。酒曲是以糧食為原料制成的物系、酶系、菌系共存的糖化發(fā)酵劑。白酒生產(chǎn)實(shí)質(zhì)上是多種微生物共同作用的結(jié)果，酒曲作為白酒生產(chǎn)中微生物的主要來(lái)源，其中的微生物按照功能可分為糖化微生物、釀酒微生物和產(chǎn)香微生物三大類[3]。

最初研究白酒微生物的方法多為傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)法。利用傳統(tǒng)方法分離到的微生物在種類和數(shù)量上是有限的，相比之下，分子生物技術(shù)則成為微生物研究強(qiáng)有力的工具。近年來(lái)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳結(jié)合（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresi，PCR-DGGE）技術(shù)、DNA克隆文庫(kù)、高通量測(cè)序等方法逐漸被應(yīng)用于白酒微生物研究。WANG H Y等[4]利用PCR-DGGE方法分析了10種酒曲的微生物類群，并對(duì)其進(jìn)行比較，證明大曲微生物群落組成具有地區(qū)差異性。陳玲等[5]運(yùn)用16S rDNA克隆文庫(kù)法與高通量測(cè)序法對(duì)比分析了濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)，兩種方法各具優(yōu)勢(shì)，在分析優(yōu)勢(shì)菌群上結(jié)果基本相同，但高通量測(cè)序法分析到的微生物類群更多。

高通量測(cè)序技術(shù)[6-7]作為新一代測(cè)序方法，在微生態(tài)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景，該技術(shù)具有通量高、成本低、準(zhǔn)確率高、可進(jìn)行雙向測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，可以方便快捷地分析樣品中復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)，是分析復(fù)雜多樣微生物樣品的首選。酒曲微生物非常復(fù)雜、種類繁多，更需要從微生態(tài)角度探究微生物的多樣性。2015年，喬曉梅[8]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了清香大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)，但只在種水平上分析了真菌組成，并沒(méi)有在其他分類水平上分析真菌；雷振河[9]基于高通量測(cè)序技術(shù)分析了山西某酒廠大曲和酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)于大曲，只有細(xì)菌門分類水平和真菌屬分類水平的分析；兩者對(duì)大曲微生物的分析都只局限于某一個(gè)分類水平，而沒(méi)有全面地從門、綱、目、科、屬、種等各個(gè)分類水平上分析微生物多樣性。本研究以北京某酒廠大曲微生物為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行16S rDNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）可變區(qū)域高通量測(cè)序，同時(shí)分析酒曲細(xì)菌和真菌的多樣性，并全面系統(tǒng)地統(tǒng)計(jì)分析酒曲微生物在門、綱、目、科、屬、種不同分類水平上的相對(duì)豐度。酒曲微生物多樣性分析對(duì)于指導(dǎo)篩選白酒釀造過(guò)程中功能微生物有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大曲樣品：取自北京某清香型白酒酒廠。

1.1.2 主要試劑

氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、異丙醇（分析純）：北京化工廠；Tris-酚：美國(guó)Sigma公司；蛋白酶K：德國(guó)Merck公司；RNA酶：日本TaKaRa Biotechnology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ProS聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）儀：德國(guó)Eppendorf公司；PowerPac3000電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酒曲樣品準(zhǔn)備

自酒廠曲房?jī)?nèi)大曲的表層、中間、底部分別取樣約10 g并粉碎至合適大小后混勻放于無(wú)菌袋中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因組DNA的提取

采用鹽析改進(jìn)法[10]提取大曲中微生物基因組DNA，具體可分為大曲預(yù)處理、核裂解液和蛋白酶K裂解、酚/氯仿/異戊醇的抽提、異丙醇的沉淀、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇的洗滌、DNA的溶解及RNA酶酶解等步驟。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的基因組進(jìn)行檢測(cè)，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

利用引物515F和806R對(duì)細(xì)菌16SrDNAV4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)利用引物ITS1F和ITS2對(duì)真菌ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；最后通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增子片段進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.4 序列數(shù)據(jù)處理與分析

得到的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)去除接頭污染、低質(zhì)量、低復(fù)雜度和含N堿基reads獲得Clean Data；使用Flash軟件利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組成一條序列得到可變區(qū)Tags，最后利用UCHIME軟件通過(guò)與嵌合體數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)去除嵌合體得到CleanTags；利用軟件USEARCH將Clean Tags進(jìn)行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，通過(guò)RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋；最后通過(guò)mothur（v1.31.2）軟件計(jì)算Alpha多樣性值并用R（v3.1.1）軟件做出相應(yīng)的稀釋曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲OTU統(tǒng)計(jì)

利用軟件USEARCH在97%相似度下將Clean Tags聚類為用于物種分類的OTU。OTU可初步說(shuō)明樣品物種豐富程度。經(jīng)分析，酒曲中的細(xì)菌OTU數(shù)為47，真菌OTU數(shù)為11，說(shuō)明酒曲微生物組成中細(xì)菌種類更為豐富。

根據(jù)每個(gè)OTU在酒曲樣品中的相對(duì)豐度，按照豐度從大到小排列，以O(shè)TU序號(hào)作為橫坐標(biāo)，OTU的相對(duì)豐度作為縱坐標(biāo)使用R（v3.1.1）軟件作圖，得到OTU Rank曲線（見(jiàn)圖1）。根據(jù)OTU統(tǒng)計(jì)結(jié)果和OTU Rank曲線圖可知，酒曲中細(xì)菌種類較真菌種類多，從每種OTU的相對(duì)豐度來(lái)看，無(wú)論細(xì)菌還是真菌在酒曲中物種組成并不均勻，說(shuō)明酒曲中不同物種含量相差較大。

圖1 大曲細(xì)菌(a)與真菌(b)OTU Rank曲線Fig.1 OTU Rank curve of bacteria(a)and fungi(b)fromDaqu

2.2 酒曲物種及其豐度分析

通過(guò)RDP classifer（v2.2）軟件對(duì)OTU代表序列分別與細(xì)菌和真菌數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種注釋。對(duì)酒曲細(xì)菌以及真菌中各物種在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)分類水平上的相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2。

表1 大曲細(xì)菌不同分類水平相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)Table 1 Relative abundance ofDaqubacteria in different classification levels

表2 大曲真菌不同分類水平相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)Table 2 Relative abundance ofDaqufungi in different classification levels

根據(jù)酒曲物種相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)表可知，細(xì)菌中以Firmicute（厚壁菌門）下的Bacilli（芽孢桿菌綱）下的Lactobacillales（乳酸桿菌目）為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度值為29.72%；在屬分類水平，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度值為18.04%、片球菌屬（Pediococcus）相對(duì)豐度值為4.45%、乳球菌屬（Lactococcus）相對(duì)豐度值為0.58%、明串珠菌屬（Leuconostoc）相對(duì)豐度值0.29%，這些細(xì)菌均為乳酸菌，此外，芽孢桿菌屬（Bacillus）相對(duì)豐度值為0.76%、埃希氏桿菌屬（Escherichia）相對(duì)豐度值為1.34%、醋桿菌屬（Acetobacter）相對(duì)豐度值為0.33%、葡萄球菌屬（Staphylococcus）相對(duì)豐度值為0.87%、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）相對(duì)豐度值為0.23%、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）相對(duì)豐度值為2.41%，同時(shí)一些豐度很低的菌屬（表1未列出）也被檢測(cè)到，如棒狀桿菌屬（Corynebacterium）相對(duì)豐度值為0.02%、黃單胞菌屬（Xanthomonas）相對(duì)豐度值為0.01%、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）相對(duì)豐度值為0.02%等，還有許多未分類的物種。

酒曲中真菌種類較少，以熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）為優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度高達(dá)98.5%；曲霉屬（Aspergillus）相對(duì)豐度值為0.89%、根毛霉屬（Rhizomucor）相對(duì)豐度值為0.08%、交鏈孢屬（Alternaria）相對(duì)豐度值為0.40%、翹孢霉屬（Emericella）相對(duì)豐度值為0.01%、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）相對(duì)豐度值為0.05%等均被檢測(cè)到。

2.3 酒曲樣品Alpha多樣性分析

Alpha多樣性（Alpha diversity）是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括observed species指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù)，shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)等。observed species指數(shù)、chao指數(shù)和ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度（species richness），這3個(gè)指數(shù)對(duì)應(yīng)的稀釋曲線還可以反映樣品測(cè)序量是否足夠，稀釋曲線是從已測(cè)得的序列中隨機(jī)抽取n條序列計(jì)算對(duì)應(yīng)的Alpha指數(shù)的期望值，然后根據(jù)n值與其相對(duì)應(yīng)的Alpha指數(shù)的期望值繪制曲線。本次研究分別針酒曲中細(xì)菌和真菌用R（V3.1.1）軟件作出的Alpha指數(shù)稀釋曲線圖，結(jié)果分別見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 大曲細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線Fig.2 Alpha diversity rarefaction curve ofDaqubacteria

圖3 大曲真菌Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線Fig.3 Alpha diversity rarefaction curve ofDaqufungi

由酒曲Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線圖可知，隨著抽取序列數(shù)增大，真菌和細(xì)菌稀釋曲線均趨于平緩，說(shuō)明本次測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。從圖3細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線可以看出只要對(duì)15 000條序列進(jìn)行測(cè)定分析就可以覆蓋酒曲所有細(xì)菌，而本次研究細(xì)菌多樣性分析了28294條序列；同樣地由圖4可知，只要對(duì)20000條序列進(jìn)行測(cè)定分析就能基本覆蓋酒曲所有真菌，而實(shí)際分析了34 931條序列。因此，本次對(duì)酒曲微生物多樣性的分析已基本覆蓋酒曲中微生物種類。

2.4 討論

乳酸菌作為大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)于白酒中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要。乳酸菌在白酒發(fā)酵過(guò)程能產(chǎn)生乳酸，乳酸又是形成乳酸乙酯的前體物質(zhì)，而乳酸乙酯是清香型白酒中除乙酸乙酯外含量最多的酯類物質(zhì)，適量的乳酸乙酯能增加酒體的醇厚感。乳球菌除發(fā)酵產(chǎn)乳酸外，也可生成乙醇、乙酸、甘油等副產(chǎn)物。此外，乳酸菌的代謝產(chǎn)物能夠維持白酒發(fā)酵的酸性環(huán)境[11-12]。除乳酸菌外，酒曲中還有芽孢桿菌、醋桿菌等細(xì)菌在白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮重要作用。一般認(rèn)為芽孢桿菌能產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶分解淀粉和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)[13-14]，此外，有些芽孢桿菌能影響白酒風(fēng)味物質(zhì)如酯、醇的形成[15]。在白酒生產(chǎn)過(guò)程中，醋酸菌的主要代謝產(chǎn)物是醋酸，是白酒中主要的酸類物質(zhì)，同時(shí)也是丁酸、己酸及酯類的前體物質(zhì)，此外，醋酸菌也可以氧化葡萄糖生成少量酒精[16]。

有很多假絲酵母屬菌株都具有酒精發(fā)酵能力，有些假絲酵母還具有生香作用[17-18]。曲霉屬真菌在白酒發(fā)酵過(guò)程中可形成糖化力、液化力、蛋白質(zhì)分解力，降解大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、淀粉形成還原糖、氨基酸、多肽等[19]，產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)微生物可以進(jìn)一步利用這些小分子物質(zhì)生產(chǎn)多種多樣的香味物質(zhì)。

酒曲質(zhì)量的好壞直接影響白酒的質(zhì)量和風(fēng)格。酒曲制作即培養(yǎng)微生物的過(guò)程，酒曲為微生物的生長(zhǎng)代謝提供了良好的環(huán)境，使得不同來(lái)源微生物可以共存其中；在制曲過(guò)程中，表現(xiàn)出微生物群落交替更迭的現(xiàn)象，形成了非常寶貴的微生物資源庫(kù)[20]。利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠快速便捷地分析酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，了解酒曲微生物分布及其中的優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)能發(fā)現(xiàn)一些未知的微生物。

3 結(jié)論

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)在不同分類水平上全面系統(tǒng)地分析了北京清香型酒曲細(xì)菌和真菌的多樣性，對(duì)酒曲樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析表明本次測(cè)序深度足以覆蓋其微生物種類。

本次研究結(jié)果表明，酒曲中細(xì)菌OTU數(shù)為47，真菌OTU數(shù)為11，且每種OTU在酒曲中分布并不均勻；酒曲中細(xì)菌種類比真菌種類豐富；對(duì)微生物的相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明，乳酸菌是北京清香型酒曲中的一類優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，主要的乳酸菌包括乳酸桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬四大類，還有其他細(xì)菌如芽孢桿菌、醋酸菌等；假絲酵母屬是酒曲中的優(yōu)勢(shì)真菌，霉菌也被檢測(cè)到如曲霉屬、根毛霉屬等；此外也檢測(cè)到一些未分類的微生物。微生物研究將會(huì)是白酒永恒的課題，分子生物技術(shù)的發(fā)展必將促進(jìn)白酒微生物的研究進(jìn)展，使人們對(duì)白酒生產(chǎn)過(guò)程中微生物的認(rèn)識(shí)不斷深入，從而促進(jìn)我國(guó)白酒的進(jìn)一步發(fā)展。

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Analysis on microbial diversity of Beijing light-flavorDaquby high-throughput sequencing

ZHANG Shuangyan1,LIAO Yonghong2,JI Nan2,ZHOU Xiaohong1*
(1.School of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China;2.School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

In order to analyze microbial diversity in Beijing light-flavorDaqu,16S rDNA V4 region and ITS1 region were analyzed by high-throughput sequencing technology,then the relative abundance ofDaqumicrobes in the different classification levels were counted.The results showed that Daqubacteria operational taxonomic units(OTU)was 47,fungi OTU was 11,the varieties of bacteria was more abundant than that of fungi.Lactic acid bacteria were the predominant bacteria,includingLactobacillus,Pediococcus,Lactococcus,Leuconostoc,andBacillusandAcetobacterwere also detected.Candidawas the predominant fungi.Aspergillus,Rhizomucor,Wickerhamomycesand other genus were also identified.Alpha diversity analysis showed that the number of analyzed sequences was enough to cover microbial species inDaqu.Finally,the possible function of dominant microbes in the process ofBaijiu-making was discussed.This study had important significance for the guidance ofBaijiu(Chinese liquor)production.

light-flavorDaqu;high-throughput sequencing;microbe;16S rDNA V4;ITS

Q93-3；TS261.1；TQ920

0254-5071（2016）11-0049-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.010

2016-08-18

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAC28B01）

張雙燕（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

*通訊作者：周曉宏（1965-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。