姚淑敏，陳璐，閆華文

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165）

應(yīng)用PCR-DGGE方法研究甜酒曲中真菌多樣性

姚淑敏，陳璐，閆華文

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165）

提取6種甜酒酒曲的總DNA，利用真菌18S rRNA基因片段的通用引物NS1、Fung-GC，采用變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）方法，進(jìn)行不同甜酒酒曲中真菌多樣性的分析。結(jié)果表明，6種甜酒酒曲中共分離出3屬真菌和不可培養(yǎng)真菌，湖南韶山的甜酒曲中主要是扣囊復(fù)膜酵母屬和根霉屬的菌株；湖南湘潭甜酒曲中的真菌為釀酒酵母屬、扣囊復(fù)膜酵母屬和根霉屬；湖南祁東、福建福州和浙江麗水甜酒曲中的真菌均為釀酒酵母屬、扣囊復(fù)膜酵母屬、根霉屬和不可培養(yǎng)真菌；浙江蘭溪甜酒曲中的真菌為根霉屬和不可培養(yǎng)真菌。在傳統(tǒng)的酒曲中的真菌主要是釀酒酵母屬和扣囊復(fù)膜酵母屬，此外不可培養(yǎng)真菌在甜酒酒曲中也起到非常重要的作用。

變性梯度凝膠電泳；甜酒曲；真菌多樣性

甜酒曲（甜酒藥）是發(fā)酵甜酒釀的發(fā)酵劑。大量研究表明，酒曲中主要有三大類微生物，即酵母菌、霉菌和細(xì)菌[1-4]。霉菌主要產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶，用于糖化作用；酵母菌主要是利用糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，種類主要有扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsia fibuligera）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、異常漢遜酵母（Hansenulaanomala）以及其他的產(chǎn)酯酵母[5-6]；細(xì)菌主要是乳酸菌，此外還有一些不可培養(yǎng)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在酒曲中起著極其重要的作用。細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸在賦予甜酒釀酸甜口感的同時(shí)，還可以與酵母菌產(chǎn)生的乙醇作用生成酯類物質(zhì)，賦予甜酒釀獨(dú)有的香氣，使其口味獨(dú)特，香氣濃郁。此外，有研究表明，乳酸菌可以產(chǎn)生乳酸菌素，具有抑制細(xì)菌的作用，在米酒發(fā)酵過(guò)程中可以抑制雜菌的生長(zhǎng)[4]。

對(duì)甜酒曲中微生物多樣性的研究由來(lái)已久。蔡俊澤等[7]從云南和黑龍江地區(qū)的傳統(tǒng)米酒中分離得到41株乳酸菌，并從中篩選出產(chǎn)酸能力較強(qiáng)以及產(chǎn)乙醛和雙乙酰能力較強(qiáng)的菌株各一株。蔡麗等[8]從孝感地區(qū)的甜酒曲中分離得到13株根霉菌，其中6株為米根霉（Rhizopus oryzae），7株為華根霉（Rhizopus chinesis）。信陽(yáng)民間傳統(tǒng)米酒中的優(yōu)勢(shì)菌為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和少根根霉（Rhizopus arrhizus），同時(shí)還分離得到少量細(xì)菌，通過(guò)血球計(jì)數(shù)法測(cè)得發(fā)酵成熟的米酒中酵母菌數(shù)量（約3.0×107個(gè)/mL米酒）最多，其次為霉菌（2～3×103個(gè)/mL米酒），細(xì)菌數(shù)量（0～102個(gè)/mL米酒）最少且差異最大[9-10]。此外，LV X C等[11]對(duì)紅曲中的微生物多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在這些傳統(tǒng)的酒曲中微生物種子資源極其豐富。

國(guó)外學(xué)者JEYARM K等[12]研究學(xué)者從當(dāng)?shù)夭煌迩f共收集54種酒曲，從中分離得到163株酵母菌菌株，最終鑒定得到9株酵母菌，其中釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae），異常漢遜酵母（Hansenula anomala）和絲孢酵母（Trichosporon pullulans）為其中的優(yōu)勢(shì)菌。DUNG N T P等[13]從米酒中分離鑒定出5株酵母菌和魯氏毛霉（Amylomycesrouxii）、少孢根霉（Rhizopus oligosporus）、米根霉（Rhizopus oryzae）等霉菌，這些根霉在淀粉糖化過(guò)程中還可以產(chǎn)生淀粉葡萄糖苷酶。YANG S Y等[14]對(duì)韓國(guó)的39種Nuruk樣品進(jìn)行研究，從中分離得到174株絲狀真菌。從日本清酒中分離得到耐酒精的酵母，同時(shí)還對(duì)該菌株在分子生物學(xué)上進(jìn)行研究，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了泛素以及乳酸菌在酒曲優(yōu)化中的作用[15]。

變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）是一種建立在聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)之上的分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)聚丙烯酰胺變性梯度凝膠將分子質(zhì)量相同而堿基組成不同的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子分離開(kāi)來(lái)?，F(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于自然界不可培養(yǎng)微生物的多樣性研究[16]。

本研究旨在通過(guò)利用PCR-DGGE方法對(duì)不同地區(qū)甜酒曲中真菌的多樣性進(jìn)行研究，了解不同地區(qū)甜酒釀風(fēng)味迥異的原因，為甜酒釀品質(zhì)的進(jìn)一步提高以及甜酒釀的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

本實(shí)驗(yàn)總共研究6種中國(guó)不同地區(qū)的甜酒曲樣品，分別為湖南韶山、湖南湘潭、湖南祁東、福建福州、浙江麗水和浙江蘭溪6個(gè)地區(qū)，并分別用1#、2#、3#、4#、5#、6#來(lái)標(biāo)記。6種甜酒曲形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 6種甜酒曲樣品Fig.1 Six kinds of sweet alcoholic drink's starters samples

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，pH 7.4，蒸餾水1 000 mL。

Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，pH 7.4，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

50×TAE電泳緩沖液：上海信裕生物技術(shù)有限公司；CaCl2（0.1 mol/L，含有15%甘油）：上海信裕生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素（10 mg/mL）、聚丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、瓊脂糖：美國(guó)Sigma-Aldrich生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器和設(shè)備

2720 Thermal cycler PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀、JY-TD331型變性梯度凝膠電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠；YXJ-2離心機(jī)：上海玉博生物科技有限公司；H6-1微型電泳槽：上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠；805凝膠成像系統(tǒng)：上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

利用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)SK8233/SK8234）提取6種甜酒曲樣品的總DNA。

1.3.2 真菌18S rDNA片段的擴(kuò)增

利用真菌18S rDNA通用引物NS1、Fung-GC（見(jiàn)表1）以提取樣品的總DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。

表1 帶有GC夾子的真菌引物Table 1 Primers of GC-fungi

表2 真菌18S rDNA PCR擴(kuò)增體系Table 2 PCR amplification system of fungus 18S rDNA

PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性：94℃4min；變性：94℃，30s；退火：54℃，45s；延伸：72℃，1min；最后延伸：72℃，10min；體系共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，4℃保存。

1.3.3 電泳檢測(cè)

吸取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。配制1.5%的瓊脂糖凝膠，放入1×TAE緩沖液中，120 V穩(wěn)壓電泳15 min，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜，檢測(cè)PCR擴(kuò)增效果。

1.3.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

取PCR產(chǎn)物各400 ng，利用D-Code突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行DGGE分析。凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)：8%（丙稀酰胺∶雙丙稀酰胺=37.5∶1），變性劑濃度范圍：15%～40%（100%的變性劑：7 mol/L尿素，40%甲酰胺）。梯度凝膠放入1×TAE電泳緩沖液中，70 V電壓，60℃恒溫電泳13 h。電泳結(jié)束，首先用超純水沖洗凝膠，然后將膠放進(jìn)染液（含TE緩沖液）中，搖床上均勻染色30 min，最后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行拍照。

1.3.5 DGGE條帶回收

選取6種樣品中有代表性的條帶，參照SK8131膠回收試劑盒的方法進(jìn)行回收處理，回收產(chǎn)物放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 PCR擴(kuò)增回收驗(yàn)證

反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件同1.3.2，引物序列如下（見(jiàn)表3）。

表3 真菌引物Table 3 Primers of fungi

PCR產(chǎn)物回收參考SK8131膠回收試劑盒的方法。

1.3.7 目的片斷的克隆測(cè)序

根據(jù)TakarapMDR18-TVector連接試劑盒說(shuō)明將目的片段和質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α中，菌液均勻涂布于含有100 μL 20 mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）和20 μL 100 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）的氨芐青霉素LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白斑。提取質(zhì)粒，片段送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序所得序列提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上，進(jìn)行BLAST序列比對(duì)進(jìn)行同源性分析，然后下載相關(guān)菌株序列信息，使用MEGA5.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)圖，并以Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行1 000次可信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌18S rDNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

以NS1和Fung-GC為擴(kuò)增引物，以提取的6種甜酒曲樣品的總DNA為模板進(jìn)行18S rDNA片段擴(kuò)增，取1.5 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，6種酒曲中分別克隆到相應(yīng)的片段，片段大小在350 bp左右。

2.2 變性梯度凝膠（DGGE）結(jié)果

取上述6種酒曲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別進(jìn)行DGGE分析，電泳圖譜如圖3所示，選取有代表性的電泳條帶進(jìn)行編號(hào)，共13條條帶，6種酒曲中的電泳條帶編號(hào)見(jiàn)表4。從圖3和表4可以看出，不同地區(qū)的酒曲中所得的電泳條帶不同，說(shuō)明不同地區(qū)的酒曲中的真菌的種類有所不同，這也進(jìn)一步推斷其發(fā)酵產(chǎn)物甜酒釀的營(yíng)養(yǎng)成分及口感也會(huì)有所不同。

圖2 真菌18S rDNA片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification product electrophoregram of fungi 18S rDNA fragment

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE電泳圖譜Fig.3 PCR amplification product electrophoregram by DGGE

表4 甜酒曲樣品中的條帶編號(hào)Table 4 Bands number of sweet alcoholic drink's startersamples

2.3 PCR擴(kuò)增

將編碼的13條DGGE片段利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收作為模板，以NS1和Fungi（不含GC夾子）為序列擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取1.5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，如圖4所示。從圖4可以看出，編碼的13條條帶分別擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，且擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為350 bp左右。

圖4 18S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification electrophoresis figure of 18S rDNA

2.4 測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，對(duì)回收片段進(jìn)行克隆，藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，并寄往上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表5。從表5看出，條帶編號(hào)為1、2的片段屬于釀酒酵母屬，條帶編號(hào)為4、5、6、7、13的片段屬于扣囊復(fù)膜酵母屬，條帶編號(hào)為8、9、10、11的片段為根霉屬，而條帶編號(hào)為12的片段屬于不可培養(yǎng)真菌。

表5 13條條帶菌種鑒定結(jié)果Table 5 Results of the molecular identification of the 13 bands

將這13條帶比對(duì)結(jié)果，利用MEGA5.0鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5。如圖5所示，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rDNA序列的相似性在95%～100%之間。條帶編號(hào)5、7與扣囊覆膜酵母（Sac chatomycopsis fibuligera）15（KP119822.1）同源性高，其相似性達(dá)到100%，4、6與扣囊覆膜酵母（Sacchatomycopsis fibuligera）15（KP119822.1）相似性達(dá)到98%；13與扣囊覆膜酵母（Sacchatomycopsis fibuligera）（AB094142.1）同源性高，相似性達(dá)到97%；條帶編號(hào)1、2與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288cRDN37-2（NR132216.1）同源性高，相似性達(dá)到99%；條帶編號(hào)12與不可培養(yǎng)真菌（Uncultured fungus clone）nco40a10c（KC670800.1）同源性高，相似性達(dá)到99%；條帶編號(hào)8、11與米根霉（Rhizopusoryzae）TY.GF1（JN003654.1）同源性高，相似性達(dá)100%，條帶編號(hào)9、10與米根霉（Rhizopus oryzae）TY.GF1（JN003654.1）相似性達(dá)到99%。這說(shuō)明在不同的酒曲中真菌的種屬主要是釀酒酵母屬（Saccharomyces）、扣囊覆膜酵母屬（Sacchatomycopsis）和根霉屬（Rhizopus）的真菌，這些菌在酒的釀造過(guò)程中起著及其重要的作用。

圖5 基于18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogentic tree based on the 18S rDNA sequences

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用DGGE技術(shù)對(duì)甜酒曲樣品中的真菌多樣性進(jìn)行了初步的分析，經(jīng)過(guò)DGGE電泳分析，挑取13條清晰條帶進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接轉(zhuǎn)化、TA克隆進(jìn)行序列鑒定，結(jié)果表明甜酒曲中的真菌主要為釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母、米根霉和不可培養(yǎng)真菌，且6種甜酒曲樣品中的真菌種類存在差異。鑒定結(jié)果為：1#甜酒曲中的真菌種類為扣囊復(fù)膜酵母和米根霉，2#甜酒曲中的真菌為釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母和米根霉，3#甜酒曲中的真菌為釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母、米根霉和不可培養(yǎng)真菌，4#甜酒曲中的真菌為釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母、米根霉和不可培養(yǎng)真菌，5#甜酒曲中真菌為釀酒酵母、扣囊復(fù)膜酵母、米根霉和不可培養(yǎng)真菌，6#甜酒曲中的真菌為米根霉和不可培養(yǎng)真菌。由此可見(jiàn)，在傳統(tǒng)的甜酒曲中，米根霉是重要的糖化菌株，其次為釀酒酵母，主要用于乙醇的發(fā)酵，另外扣囊復(fù)膜酵母在酒曲中起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微生物的非培養(yǎng)鑒定技術(shù)結(jié)合PCR-DGGE分子生物學(xué)手段，非常有利于酒曲微生物資源和不可培養(yǎng)真菌的研究，這比前期利用可培養(yǎng)方法進(jìn)行的微生物多樣性分析結(jié)果更加豐富[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果極大的豐富了湖南、福建、浙江三地的酒曲中微生物種子資源，為進(jìn)一步研究我國(guó)南方地區(qū)酒釀風(fēng)味物質(zhì)特征、改進(jìn)傳統(tǒng)的配料和釀造工藝奠定了理論基礎(chǔ)。

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Diversity of fungi in sweet alcoholic drink's starters by PCR-DGGE method

YAO Shumin,CHEN Lu,YAN Huawen
(College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China)

The total DNA in the six kinds of sweet alcoholic drink's starters was extracted,using the universal primer NS1 and Fung-GC of fungus 18S rRNA gene segment,the diversity of fungi in the different starters was analyzed by PCR-DGGE.The results showed that three genera of fungi and unculturable fungi were isolated from six kinds of the starters.The main fungi wereSaccharomycopsisandRhizopusin the Hunan Shaoshan sweet alcoholic drink's starters.Saccharomyces,SaccharomycopsisandRhizopuswere the main fungi in Hunan Xiangtan sweet alcoholic drink's starters.Saccharomyces,Saccharomycopsis,Rhizopusand unculturable fungi were the main fungi in Hunan Qidong,Fujian Fuzhou and Zhejiang Lishui sweet alcoholic drink's starters.Rhizopusand unculturable fungi were main fungi in Zhejiang Lanxi sweet alcoholic drink's starters. SaccharomycesandSaccharomycopsiswere the main fungi in the traditional starters.In addition,the unculturable fungi also played a very important role in sweet alcoholic drink's starters.

PCR-DGGE;sweet alcoholic drink's starter;fungal diversity

TS261.1

0254-5071（2016）11-0044-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.009

2016-07-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31200400）；曲阜師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（sk201407）

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源和利用。