董曉麗，李香串

(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006)

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豬苓優(yōu)良菌株分離及培養(yǎng)基篩選研究

董曉麗，李香串

(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006)

比較研究了不同產(chǎn)地、不同取材部位的豬苓菌絲生長(zhǎng)狀況并結(jié)合產(chǎn)地、品質(zhì)等條件優(yōu)選出優(yōu)良的菌株并對(duì)該菌株進(jìn)行了培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明：盂縣1號(hào)優(yōu)于其它品種，最適培養(yǎng)基為HBL：馬鈴薯200 g，小麥麩皮50 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g，蛋白胨5 g，水1000 mL，pH 值自然。

豬苓；菌株分離；培養(yǎng)基；篩選

豬苓 [Polyporusumbellatus(Pers.)Fr.]，又名豬糞菌、豬苓芝。屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、豬苓屬，是傳統(tǒng)的真菌藥物之一[1]，具有利尿滲濕、通淋退腫、防老助顏等功效[2]。多糖是豬苓的主要活性成分之一，具有保護(hù)肝臟細(xì)胞、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[3]；麥角甾醇是豬苓標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)成分之一，具有一定的利尿作用[4-5]。目前多以野生品供應(yīng)市場(chǎng)，且不同產(chǎn)地的豬苓品質(zhì)參差不齊，野生豬苓資源日趨減少，人工種植及工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，可以緩解野生豬苓資源枯竭狀況。本研究在前述不同產(chǎn)地豬苓有效成分的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)分離不同產(chǎn)地的豬苓及豬苓花的菌絲體，比較研究不同菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，篩選出優(yōu)良菌株和適宜其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，為豬苓良種選育及工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同菌株菌絲生長(zhǎng)狀況的比較試驗(yàn)

1.1.1 供試菌株

選取的6 個(gè)供試菌株均為項(xiàng)目組自采并分離獲得，平山 1號(hào)(采自河北平山，分離部位為白苓)；平山2號(hào)(采自河北平山，分離部位為白苓)；盂縣1號(hào)(采自盂縣太行山，分離部位為豬苓花)；盂縣3號(hào)(采自盂縣太行山，分離部位為白苓)；沁源(采自沁源太岳山，分離部位為豬苓花)；留壩(采自陜西留壩縣，分離部位為黑苓)。

1.1.2 培養(yǎng)基的制備

配制PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g 水1 000 mL，pH值自然)，分裝于試管中，121 ℃滅菌20 min，取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 接種與培養(yǎng)

從母種中，挑選無(wú)雜菌，長(zhǎng)勢(shì)旺盛的菌絲，沿菌落邊緣切下0.5 cm2活化菌塊，接種到PDA培養(yǎng)基試管斜面上，每一種培養(yǎng)基接20 管, 放置在(25 ±2)℃培養(yǎng)室培養(yǎng)。定時(shí)觀察、記錄菌絲萌發(fā)及生長(zhǎng)狀況。

1.1.4 菌絲生長(zhǎng)狀況測(cè)定

發(fā)菌7 天后，每隔3 天用毫米刻度尺測(cè)量不同菌株菌絲的生長(zhǎng)量，并計(jì)算出生長(zhǎng)速度，然后取平均值進(jìn)行LSR測(cè)驗(yàn)；同時(shí)觀察并記錄菌絲密度、菌絲顏色、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)。

1.2 最適培養(yǎng)基質(zhì)試驗(yàn)

1.2.1 供試菌種

盂縣1號(hào)菌株。

1.2.2 供試培養(yǎng)基組成成分(見(jiàn)表1)

表1 四種培養(yǎng)基的組成成分

注：1)加水量均為1 000 mL；2)維生素B1單位：mg。

1.2.3 試驗(yàn)方法

將四種配方中的馬鈴薯、小麥麩皮煮沸10～15 min后過(guò)濾取汁，其它成分按配方準(zhǔn)確稱(chēng)量， pH自然，20 mm×200 mm試管每支裝10 mL，每個(gè)配方各裝20 支，高壓滅菌20 min，取出制斜面8 cm等長(zhǎng)，待冷卻后接入豬苓菌種，接種點(diǎn)一致，置25 ℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)，觀測(cè)菌絲萌發(fā)，生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LSR測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地菌株菌絲生長(zhǎng)狀況比較試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 各菌株菌絲的生長(zhǎng)速度比較

表2 各菌株菌絲生長(zhǎng)速度比較 mm/d

從表2可看出，不同產(chǎn)地豬苓菌株間菌絲生長(zhǎng)速度不同，平山2號(hào)菌絲生長(zhǎng)速度最快，平均日生長(zhǎng)速度為4.93 mm，其次為盂縣1號(hào)和平山1號(hào)，菌絲平均日生長(zhǎng)速度分別為3.39 mm和2.91 mm，留壩黑苓生長(zhǎng)速度最慢，日平均生長(zhǎng)速度為1.67 mm。

2.1.2 試驗(yàn)結(jié)果及分析

表3 各菌株菌絲生長(zhǎng)速度的新復(fù)極差(LSR)測(cè)驗(yàn)

注：數(shù)字后*表示p<0.05，**表示p<0.01。

從表3可看出，平山2號(hào)菌株菌絲生長(zhǎng)速度較快，與盂縣1號(hào)和平山1號(hào)比較差異顯著，與沁縣白苓、盂縣3號(hào)及留壩黑苓菌株菌絲比較差異極顯著。

2.1.3 各菌絲生長(zhǎng)狀況比較

表4 各菌絲生長(zhǎng)狀況比較

由表4可知，平山2號(hào)菌絲顏色白、菌絲短、菌絲稠密、粗壯，其次為盂縣1號(hào)菌絲顏色白、菌絲長(zhǎng)、菌絲較稀、粗壯。留壩黑苓菌株生長(zhǎng)狀況最次。

2. 2 盂縣1號(hào)菌株的最適培養(yǎng)基篩選結(jié)果及分析

2. 2.1 不同培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)狀況比較

表5 不同培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況

從表5得知，盂縣1號(hào)菌株在四種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況不同，以在配方HBL上的長(zhǎng)速最快，配方B其次；而配方WBA和PDA上生長(zhǎng)稀疏、較弱，不適合；配方HBL、B上菌絲生長(zhǎng)健壯、較密，且爬壁力強(qiáng)。

2. 2.2 不同培養(yǎng)基中豬苓菌絲的生長(zhǎng)速度

從表6得知，盂縣1號(hào)菌株在不同培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度不同，在HBL培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，平均日生長(zhǎng)速度為1.46 mm，其次為B培養(yǎng)基，菌絲平均日生長(zhǎng)速度分別為1.22 mm，WBA和PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)速度最慢。

表6 不同培養(yǎng)基中各菌株菌絲生長(zhǎng)速度 mm/d

2. 2.3 菌絲生長(zhǎng)速度的新復(fù)極差(LSR)測(cè)驗(yàn)

表7 菌絲生長(zhǎng)速度的新復(fù)極差

注：數(shù)字后﹡表示p<0.05，﹡﹡表示p<0.01。

從表7得知，盂縣1號(hào)菌株在HBL培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，與WBA、B比較差異顯著與PDA比較差異極顯著。

3 結(jié)果與討論

3.1 比較的六株菌株中平山2號(hào)、盂縣1號(hào)、分離部位為子實(shí)體，沁源白苓、留壩黑苓分離部位為菌核，試驗(yàn)結(jié)果表明：平山2號(hào)與盂縣1號(hào)在菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲密度、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和攀爬力方面都優(yōu)于從菌核分離的菌株。以分離部位作選種指標(biāo)分離菌種時(shí)，分離部位應(yīng)首選子實(shí)體。

3.2 不同菌株間菌絲生長(zhǎng)狀況試驗(yàn)表明：平山2號(hào)的表現(xiàn)最好，其次為盂縣1號(hào)，優(yōu)于其他四個(gè)菌株，由于盂縣1號(hào)產(chǎn)于山西，屬于道地藥材，其子實(shí)體中多糖含量及甾醇含量均高于其它品種[6]，因此盂縣1號(hào)可作為本地區(qū)的首選品種。

3.3 從菌絲生長(zhǎng)狀況、生長(zhǎng)速度等方面研究了盂縣1號(hào)豬苓菌種在4種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明：培養(yǎng)基HBL是豬苓菌絲最適培養(yǎng)基，其次為培養(yǎng)基B。由此推斷配方中含有維生素B1和小麥麩皮對(duì)豬苓菌絲的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

3.4 盂縣1號(hào)作為山西道地藥材，在生長(zhǎng)狀況及品質(zhì)方面均優(yōu)于其他菌株，可作為本地區(qū)擴(kuò)大化培養(yǎng)的首選品種。另外培養(yǎng)基HBL中加入維生素B1和小麥麩皮不僅有利于其菌絲生長(zhǎng)，其培養(yǎng)基褐化程度也明顯降低。本研究通過(guò)篩選優(yōu)良的豬苓菌株和最佳培養(yǎng)條件，以期為豬苓的大規(guī)模人工栽培提供參考。

[1] 黃年來(lái)．中國(guó)食用菌百科[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1993:1 .

[2] 許廣渡，傅偉杰，趙旭奎．我國(guó)豬苓研究的進(jìn)展[J]．菌物研究，2003，I(1)：58-63.

[3] 陸勇芹，周文明，王琦，等．木蹄層孔菌化學(xué)成分及不同提取物體外抗腫瘤活性研究[J]．西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22(4)：131-13.

[4] ZHAO Y Y，XIE RM，CHAO X，et a1．Bioactivitydirected isolation，identification of diuretic compounds from Polyporus umbellatus[J]．Journal of Ethnopharmacology，2009,126:184-187.

[5] 劉洪超，楊小龍，王淑英．豬苓藥理作用研究進(jìn)展[J]．河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011,29(2):1.

[6] 李香串，梁文儀．不同產(chǎn)地野生豬苓多糖與麥角甾醇的含量分析[J]．中國(guó)野生植物資源，2014,33(4)：11-15.

Study on the Strain Isolation and Medium Screening ofPolyporusumbellatus

Dong Xiaoli ，Li Xiangchuan

(Medicine and Life Science Institute of Shanxi Province，Taiyuan 030006，China)

The mycelia growth conditions of different parts and producing areas ofPolyporusumbellatuswere studied and the fine strains were selected to do culture media screening tests. The esperiment results showed that Pingshan 2 is better than the other varieties and the optimum medium was: potato 200 g,bran 50 g,KH2PO43 g,MgSO41.5 g,VB110 mg,agar 20 g,peptone 5 g ,and water 1000 mL,pH natural。

Polyporusumbellatus；strain isolation；culture media；selection

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.009

2016-01-06

山西省社會(huì)發(fā)展科技公關(guān)項(xiàng)目(20130313013-5)，山西省特色藥材規(guī)范化種植技術(shù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究—豬苓良種選育研究。

董曉麗(1980—)，女，碩士，工程師，研究方向?yàn)樗幱弥参镌耘嘤N。E-mail：75499571@qq.com

S646.2

A

1006-9690(2016)05-0035-02