宋潔瓊, 吳 威, 陳 嵩, 諸杜明, 鐘 鳴

復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學科，上海 200032

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·論 著·

褪黑素對脂多糖誘導的膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用

宋潔瓊, 吳 威, 陳 嵩, 諸杜明, 鐘 鳴*

復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學科，上海 200032

目的： 探討褪黑素(MT)對脂多糖(LPS)誘導的膿毒癥大鼠肺損傷組織的保護作用。方法： 成年清潔級SD雄性大鼠72只，隨機分為對照組(靜脈注射0.9%氯化鈉溶液)、LPS組(靜脈注射LPS 1 mg/kg)、LPS+MT1組(靜脈注射MT 0.1 mg/kg+LPS 1 mg/kg)、LPS+MT2組(靜脈注射MT 1 mg/kg+LPS 1 mg/kg)，每組18只。給藥后6 h取血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-10的含量；取大鼠肺組織，勻漿，測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和髓過氧化物酶(MPO)含量。結(jié)果： LPS組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平較對照組顯著升高(P<0.01)；給予MT干預(yù)后，大鼠TNF-α、IL-6水平下降而IL-10水平上升(P<0.05)，且這一效應(yīng)隨MT劑量增加而增大。LPS組大鼠肺組織SOD含量較對照組明降低，而MDA和MPO含量顯著升高(P<0.01)；給予MT干預(yù)后，大鼠SOD水平有顯著升高，MDA和MPO水平明顯下降(P<0.05)，且這一效應(yīng)隨MT劑量增加而增大。結(jié)論： MT可降低LPS誘導的膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，并能有效拮抗脂質(zhì)過氧化造成的肺組織損傷，起到一定的肺保護作用；MT對肺損傷組織的保護作用與其劑量正相關(guān)。

褪黑素；脂多糖；膿毒癥；腫瘤壞死因子-α；白介素

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情兇險且病死率高，是重癥監(jiān)護病房患者最主要的死亡原因之一。雖然近年來各臟器功能的支持治療手段顯著提高，但膿毒癥患者的死亡率仍居高不下，嚴重影響人們的生活質(zhì)量。褪黑素(melatonin, MT) 是松果體分泌的吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，化學名為N-乙酰-5-甲氧色胺[1]。該物質(zhì)由5-羥色胺經(jīng)兩步酶促反應(yīng)生成，因其經(jīng)提純后可以使兩棲類動物皮膚變白，因此又命名為褪黑素。多項基礎(chǔ)[2-8]研究發(fā)現(xiàn)，其有調(diào)節(jié)生物鐘、改善睡眠、抗焦慮、抗炎、抗氧化、清除氧自由基、調(diào)節(jié)免疫以及抗腫瘤等功能。其中，抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用對膿毒癥的治療可能有重要意義。本研究擬通過靜脈注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)制造大鼠膿毒癥模型，并給予不同治療劑量的MT，探討MT對膿毒癥大鼠肺損傷組織的保護作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 成年清潔級SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量(200±20) g，購自南京君科生物工程有限公司。MT、LPS均為Sigma 公司產(chǎn)品；大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和IL-10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自晶美生物工程(北京)有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物模型制備與分組 所有大鼠實驗前禁食12 h，不禁水。將這些大鼠隨機分為4組，每組18只。對照組：尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液；LPS組：尾靜脈注射LPS 1 mg/kg；LPS+MT1組：先尾靜脈注射MT 0.1 mg/kg，30 min后再注射LPS 1 mg/kg；LPS+MT2組：先尾靜脈注射MT1 mg/kg，30 min后再注射LPS 1 mg/kg。各組大鼠均在自然光照下飼養(yǎng)，MT給藥均在9：00至10：00完成。

1.3 血清TNF-α、IL-6、IL-10含量檢測 各組大鼠均在完成靜脈注射后6 h經(jīng)戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)頸動脈取血后處死。將全血經(jīng)離心機離心后取血清，-20℃凍存待用。采用ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10的含量，按ELISA試劑盒說明書操作。

1.4 肺組織SOD、MDA、MPO含量測定 取大鼠新鮮肺組織，加入0.9%氯化鈉液，用電動勻漿器制備10%肺組織勻漿。制作勻漿過程于冰水中進行。按各自檢測試劑盒說明書測定肺組織中SOD、MDA和MPO含量。

2 結(jié) 果

2.1 血清TNF-α、IL-6和IL-10含量變化 結(jié)果(表1)表明：對照組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量均處于正常范圍的較低水平。LPS組大鼠在注射LPS后6 h，上述指標均較對照組明顯上升(P<0.01)。LPS+MT1組大鼠TNF-α、IL-6含量雖仍顯著高于對照組，但較LPS組下降(P<0.05)；LPS+MT1組IL-10含量明顯高于對照組，但與LPS組差異無統(tǒng)計學意義。LPS+MT2組大鼠TNF-α、IL-6含量進一步下降，低于LPS+MT1組(P<0.05)；LPS+MT2組IL-10含量較LPS+MT1組升高，且顯著高于LPS組(P<0.05)。

表1 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量 pg/mL；

aP<0.01與對照組相比；bP<0.05與LPS組相比；cP<0.05與LPS+MT1組相比

2.2 肺組織SOD、MDA、MPO含量變化 結(jié)果(表2)表明：LPS組大鼠SOD含量明顯低于對照組，而MDA和MPO含量明顯高于對照組(P<0.01)。LPS+MT1組大鼠SOD含量仍顯著低于對照組，但較LPS組升高(P<0.05)；LPS+MT1組MDA和MPO含量仍高于對照組，但較LPS組下降(P<0.05)。LPS+MT2組大鼠SOD含量較LPS+MT1組升高，但仍低于對照組(P<0.05)；LPS+MT2組MDA和MPO含量較LPS+MT1組進一步降低，但仍高于對照組(P<0.05)。

表2 大鼠肺組織SOD、MDA、MPO含量

aP<0.01與對照組相比；bP<0.05與LPS組相比；cP<0.05與LPS+MT1組相比

3 討 論

LPS誘導的膿毒癥可導致組織細胞缺血、缺氧，而液體復(fù)蘇和血管活性藥物又造成組織缺血-再灌注損傷，并由此引起細胞氧超載，加重炎癥反應(yīng)，導致組織細胞壞死、凋亡，最終發(fā)生多器官功能衰竭。MT作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有清除氧自由基、改善線粒體功能、調(diào)節(jié)細胞凋亡、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用。

TNF-α和IL-6是重要的促炎及免疫調(diào)節(jié)因子，通過生成細胞因子和炎癥趨化因子激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)，增加內(nèi)皮黏附因子的表達，促進中性粒細胞對血管內(nèi)皮細胞的黏附，導致靶器官損傷，從而引起各種臨床癥狀[9]。而IL-10是巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的抗炎癥因子，能夠通過下調(diào)促炎癥因子的表達來抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)[10]，還可以降低巨噬細胞產(chǎn)生的自由基、氮氧化物等有害物質(zhì)的水平。有研究[11]表明，給LPS誘導的膿毒癥休克小鼠腹腔注射MT能降低TNF-α、IL-12和IFN-γ等促炎因子水平，而增加抗炎因子IL-10的含量。本研究中，LPS組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平均明顯高于對照組，可見LPS導致的膿毒癥狀態(tài)下促炎和抗炎反應(yīng)均加強。給予小劑量MT的LPS+MT1組大鼠血清TNF-α和IL-6水平雖仍顯著高于對照組，但較LPS組有明顯下降，而IL-10水平有上升趨勢；而給予大劑量MT的LPS+MT2組大鼠血清TNF-α和IL-6水平較LPS+MT1組進一步下降，IL-10水平上升且顯著高于LPS組。本研究表明，MT降低促炎因子TNF-α和IL-6水平的同時能提高抗炎因子IL-10的濃度，起到維持促炎/抗炎平衡的作用，這與既往研究[11-12]結(jié)果相符，而且本研究進一步顯示這一作用與MT劑量正相關(guān)。

MT可從多個環(huán)節(jié)上防止自由基損傷，包括阻止自由基氧化的連鎖反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化，并與其他抗氧化劑協(xié)同減少自由基的生成[13-16]。還原型谷胱甘肽可以還原脂質(zhì)過氧化物，從而消除其對細胞膜的損傷；而MT可以通過增強組織中谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性，促使氧化型谷胱甘肽還原，從而起到保護細胞膜的作用[17-18]。SOD是機體清除氧自由基最重要的酶之一，其含量可以反映機體內(nèi)抗氧化酶的活性及其清除氧自由基的能力。MT可以提高SOD、過氧化氫酶等有清除自由基及抗氧化作用酶的活性及其mRNA表達水平[14,19]。MDA是氧自由基通過攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化而形成的產(chǎn)物，是反映氧化損傷程度的指標之一。MPO是血紅素過氧化物酶超家族成員之一，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，是中性粒細胞的功能和激活標志，其水平及活性代表嗜中性多形核白細胞的功能和活性狀態(tài)。MPO過度表達亦會引起氧化應(yīng)激，導致氧化性組織損傷。本研究顯示，LPS組大鼠肺組織SOD水平較對照組明顯下降，而MDA和MPO水平顯著上升，提示膿毒癥狀態(tài)下，肺組織清除自由基的能力下降，發(fā)生嚴重氧化應(yīng)激損傷；LPS+MT1組大鼠SOD水平較LPS組上升，而MDA和MPO水平則下降，這一趨勢在LPS+MT2組中更明顯?？梢奙T可以減輕LPS導致的氧化損傷，并且這一作用隨MT劑量的增加而增強。

綜上所述，MT可減輕LPS誘導的膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，并有效拮抗脂質(zhì)過氧化造成的肺組織損傷，起到一定的肺保護作用，而且這一效應(yīng)與MT的劑量正相關(guān)。然而，MT的抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫的機制非常復(fù)雜，受多方面因素的影響，因此尚需要進一步的藥理研究及臨床試驗來證明其有效性、安全性和遠期效果。

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[本文編輯] 姬靜芳

Protective effects of melatonin on lung injury induced by lipopolysaccharide in rats with sepsis

SONG Jie-qiong, WU Wei, CHEN Song, ZHU Du-ming, ZHONG Ming*

Department of Critical Care Medicine, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To investigate the protective effects of melatonin (MT) on lung injury induced by lipopolysaccharide (LPS) in rats with sepsis. Methods： Seventy-two rats were randomly divided into four groups with 18 rats in each group: control group (0.9% NS,i.v.), LPS group (LPS 1 mg/kg,i.v.), LPS+MT1 group (MT 0.1 mg/kg+LPS 1 mg/kg,i.v.) and LPS+MT2 group (MT 1 mg/kg+LPS 1 mg/kg,i.v.). Carotid arterial blood of all rats was collected at 6 h after administration and serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-10 (IL-10) were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The lung homogenate contents of superoxide dismutase(SOD), malondialdehyde(MDA) and myeloperoxidase (MPO) were also examined. Results： Compared with control group, the levels of serum TNF-α, IL-6 and IL-10 were significant higher in LPS group (P<0.01). With the MT intervention, the levels of TNF-α and IL-6 were significantly decreased but the IL-10 level was remarkably increased (P<0.05). This effect was more remarkable with the increase of the dose of MT. The level of SOD in LPS group was remarkably lower than in control group, but the levels of MDA and MPO were significantly higher (P<0.01). Compared with LPS group, the level of SOD in LPS+MT1 group was significantly increased，however，the contents of MDA and MPO were decreased (P<0.05). The same trend was more prominent in LPS+MT2 group.Conclusions： MT can decrease the lung injury by reducing the inflammatory response and lipid peroxidation induced by LPS in rats with sepsis. The protective effect was positively associated with the dose of MT.

melatonin; lipopolysaccharide; sepsis; tumor necrosis factor-α; interleukin

2106-05-06 [接受日期] 2016-07-27

復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院青年科學基金(2014ZSQN64). Supported by Youth Science Found of Zhongshan Hospital,Fudan University(2014ZSQN64).

宋潔瓊，碩士，主治醫(yī)師. Email：song.jieqiong@zs-hospital.sh.cn

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990，E-mail：zhong.ming@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160545

R 453.9

A