王世強，常 蕓，饒志堅，馬曉雯

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運動性心房損傷和纖維化發(fā)生過程中Smad基因和蛋白的表達變化

王世強1,2，常 蕓2，饒志堅2，馬曉雯2

目的：探討運動性心房纖維化發(fā)生過程中大鼠心房Smad信號通路調(diào)控分子的表達變化。方法：8周齡SD雄性大鼠48只，隨機分為安靜對照組和大強度運動組，每組又分為8周組、12周組和16周組，大強度組分別進行8周、12周和16周的跑臺運動。采用熒光定量PCR和Western Blot檢測心肌Smad-2、Smad-4和Smad-7 mRNA與蛋白的表達。結(jié)果：與安靜對照組相比，大強度組Smad-2的表達有增加趨勢，但無顯著性差異。16周大強度運動后，Smad-4 mRNA和蛋白的表達均顯著性增加(P<0.05，P<0.01)。Smad-4 mRNA的表達隨著時間的延長而增加，16周大強度組顯著高于8周大強度組(P<0.05)。12周和16周大強度運動后，Smad-7 mRNA和蛋白的表達均顯著性降低(P<0.05)。隨運動時間的延長，Smad-7 mRNA的表達逐漸降低，12和16周大強度組顯著低于8周大強度組(P<0.01)。結(jié)論：長期大強度運動導(dǎo)致大鼠心房Smad-4的表達持續(xù)上調(diào)，而Smad-7的表達進行性降低，各型Smad之間表達失調(diào)，可能是運動性心房損傷和纖維化發(fā)生的分子病理機制。

大強度運動；心房；纖維化；Smad；心房纖顫

運動性心律失常是備受研究者關(guān)注的問題。心房纖顫是最常見的運動性心律失常，會制約運動員比賽成績的提高，影響運動員的身體健康和生命安全[2]。研究證實，運動性心房纖顫的發(fā)生與運動的劇烈程度及累積時間有關(guān)[18]。有研究表明，長期反復(fù)大強度運動導(dǎo)致了心房纖維化發(fā)生，可能是運動性心房纖顫的主要病理改變[10]。本課題組前期研究也證實了16周大強度跑臺運動會造成大鼠心房纖維化的發(fā)生[6,7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，長期大強度運動導(dǎo)致大鼠心房轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的長期高表達，可能介導(dǎo)了心房損傷和間質(zhì)纖維化的發(fā)生過程[8]。Smad(small mother against decapentaplegic)作為TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游信號分子，與細

胞膜上TGF-β受體結(jié)合并將信號傳遞至細胞核內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用[37]。Smad在細胞外基質(zhì)重塑和組織損傷修復(fù)過程中具有重要作用。研究證實，在糖尿病和心肌梗死等多種疾病誘導(dǎo)的心房纖維化發(fā)生過程中均存在Smad異常表達[16,25,29]。Smad在運動性心房損傷和纖維化發(fā)生中的作用，鮮見相關(guān)報道。鑒于此，本研究通過建立長期大強度運動動物模型，觀察Smad(Smad-2、Smad-4和Smad-7)基因和蛋白的表達變化，以期為揭示運動性心房損傷和纖維化的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)，為運動性心房纖顫的預(yù)防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

8周齡SPF級SD大鼠購置于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。在國家體育總局體育科學(xué)研究所ABSL-3級實驗動物房飼養(yǎng)，普通嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，恒溫恒濕，每天光照12 h。

1.2 動物分組與運動方案

1.3 取材

運動8周、12周和16周結(jié)束后的第2天，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后摘心臟，分離出右心房，組織分為兩份，經(jīng)液氮速凍后存于-80℃超低溫冰箱，一份用于RT-PCR，一份用于Western blot。

1.4 熒光定量PCR檢測mRNA的表達

取組織放入液氮預(yù)冷的研缽中，研磨成粉末后加入Trizol裂解，加入氯仿抽提，離心后加入氯丙醇，再次離心后經(jīng)75%的酒精洗滌，離心后晾干加入去離子水，測量RNA的濃度和純度。每個樣本按0.5 μg總RNA 10 μl的反應(yīng)體系，采用cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒(RR370A，購于Takara生物公司)反轉(zhuǎn)成cDNA后，-20℃保存。以合成的cDNA為模板，加入上下游引物，采用試劑盒(RR820A，購于Takara生物公司)在ABI 7300熒光定量檢測系統(tǒng)進行檢測。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s，PCR反應(yīng)95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，用Excel分析處理，通過2-△△CT公式計算樣本中mRNA的相對含量，其中，△△CT=(CT實驗組目的基因-CT實驗組內(nèi)參基因)-(CT對照組目的基因-CT對照組內(nèi)參基因)。采用β-actin作為參照物，所有引物均通過GenBank數(shù)據(jù)庫查詢設(shè)計，由上海生工生物有限公司合成。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR基因引物序列

1.5 Western Blot檢測蛋白的表達

組織經(jīng)液氮研磨后，加入蛋白裂解液(RIPA，購于碧云天公司)和蛋白酶抑制劑(PMSF，購于碧云天公司)。離心后采用BCA法測其濃度，通過加入不同量的去離子水使所有樣本蛋白總量一致，按5:1加入上樣緩沖液(購于碧云天公司)，最終使總蛋白濃度為4 μg/μl。水浴鍋內(nèi)沸騰水煮10 min使蛋白變性。采用10%的膠，120 V恒壓電泳1.5 h，200 mA恒流濕轉(zhuǎn)1 h。脫脂奶粉封閉PVDF膜(購于美國Millipore公司)1 h，加入一級抗體(β-actin 濃度為1∶5 000，Smad-2和Smad-4濃度為1∶1 000，Smad-7濃度為1∶500，購于美國Abcam公司)，二級抗體(1∶5 000，購于美國Abcam公司)4℃搖床過夜。PBST洗膜后，加入發(fā)光液(購于美國Millipore公司)，放入暗匣，在暗室內(nèi)X光片曝光數(shù)十秒。顯影數(shù)秒，定影液定影。條帶在Quantiy One軟件下分析。計算目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.6 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用 GraghPad Prism 6.0軟件轉(zhuǎn)換作圖。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0進行分析處理，結(jié)果采用平均數(shù)±標準差表示，采用雙因素方差分析組間差異。顯著性差異選擇P<0.05或P<0.01水平。

2 實驗結(jié)果

2.1 Smad-2基因和蛋白的表達

Smad-2基因和蛋白的表達變化見圖1、圖2。與安靜對照組相比，8周、12周和16周運動后，心房Smad-2 基因和蛋白的表達均有所增加，但均無顯著性差異。

圖1 Smad-2 mRNA的表達變化柱狀圖

圖2 Smad-2 蛋白的表達變化示意圖

2.2 Smad-4基因和蛋白的表達

Smad-4 mRNA的表達變化見圖3。8周和12周運動后，和安靜對照組相比，大強度組心肌Smad-4 mRNA表達均有升高趨勢，但均無明顯差異。16周運動后，大強度組Smad-4 mRNA表達顯著高于安靜對照組(P<0.05)。對比8周、12周和16周大強度組，隨時間的延長，Smad-4 mRNA表達逐漸增加。16周大強度組右心房Smad-4 mRNA表達顯著高于8周大強度組(P<0.05)。

圖3 Smad-4 mRNA的表達變化柱狀圖

Smad-4蛋白的表達變化見圖4。和基因的變化趨勢一致，8周和12周運動后，和安靜對照組相比，大強度組心肌Smad-4蛋白表達均有升高趨勢，但均無明顯差異。16周運動后，大強度Smad-4蛋白表達顯著高于安靜對照組(P<0.01)。

圖4 Smad-4蛋白的表達變化示意圖

2.3 Smad-7基因和蛋白的表達

Smad-7 mRNA的表達變化見圖5。8周運動后，和安靜對照組相比，大強度組Smad-7 mRNA表達均有降低趨勢，但均無明顯差異。12周和16周運動后，Smad-7 mRNA表達顯著低于安靜對照組(P<0.05)。對比8周、12周和16周大強度組，隨著時間的延長，Smad-7 mRNA表達逐漸有降低趨勢。12周和16周大強度組Smad-7 mRNA均顯著低于8周大強度組(P<0.01)。

圖5 Smad-7 mRNA的表達變化柱狀圖

和基因的變化趨勢一致，Smad-7蛋白的表達變化見圖6。8周運動后，和安靜對照組相比，大強度組Smad-7蛋白的表達均有降低趨勢，但均無明顯差異。12周和16周運動后，右心房Smad-7蛋白的表達顯著低于安靜對照組(P<0.05)。

圖6 Smad-7蛋白的表達變化示意圖

3 討論

Smad蛋白是TGF-β1的下游信號分子，包括3種：1)受體型Smad蛋白(R-Smads)，主要是Smad-2和Smad-3；2)通用Smad蛋白(Co-Smad)，主要有Smad-4；3)抑制型Smad蛋白(I-Smads)，主要有Smad-6和Smad-7[27]?；罨腡GF-β1受體分子使Smad-2和Smad-3發(fā)生磷酸化，然后與Smad-4結(jié)合形成Smad復(fù)合物，該復(fù)合物隨即轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，與各種轉(zhuǎn)錄因子相互作用以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。而Smad-7可與TGF-β1的受體競爭性結(jié)合，阻止R-Smad的磷酸化，從而阻斷TGF-β1的效應(yīng)[28]。在正常生理狀態(tài)下，心肌TGF-β1/Smad 信號通路中各型Smad 分子之間精密協(xié)調(diào)。在異常情況下，R-Smads與I-Smads表達失衡是誘發(fā)纖維化的分子基礎(chǔ)之一[14,38]。

過量的TGF-β1與細胞膜上的受體結(jié)合進而造成胞內(nèi)Smad表達失衡，進一步通過促進成纖維細胞的增殖、成纖維細胞向成肌纖維細胞轉(zhuǎn)化并且促進CTGF表達的增加，最終使細胞外基質(zhì)的合成增加，誘導(dǎo)器官纖維化發(fā)生[19]。另外，TGF-β1還可通過與Smad作用后促進TIMP的表達，抑制MMP的表達和活性，MMP/TIMP的比例失調(diào)，細胞外基質(zhì)降解減少，促進纖維化的發(fā)生[12]。前期研究證實，長期大強度運動誘導(dǎo)大鼠心房膠原蛋白含量增加，Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比例失調(diào)，心房發(fā)生纖維化[6,7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，心房TGF-β1的含量顯著增加，可能是運動性心房纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因子[8]。Smad蛋白是介導(dǎo)TGF-β1發(fā)生作用的重要調(diào)控蛋白，在運動性心房損傷和纖維化發(fā)生過程中，Smad蛋白的變化規(guī)律如何，目前鮮有相關(guān)報道。

本研究結(jié)果表明，16周大強度運動后，心房Smad-2的表達無明顯變化。與本研究結(jié)果一致，Lessard等[21]研究報道，急性大強度運動后，大鼠比目魚肌Smad-2的總蛋白無明顯改變，而Smad-2蛋白磷酸化增加，可能誘導(dǎo)了骨骼肌ECM發(fā)生重塑，導(dǎo)致代謝風(fēng)險因子增加和運動能力降低。也有研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞的增殖誘導(dǎo)了心肌纖維化的發(fā)生，Smad-2總蛋白并未明顯增加，而Smad-2蛋白的磷酸化表達上調(diào)[40]。本研究中雖未發(fā)現(xiàn)明顯的Smad-2上調(diào)，但長期大強度運動是否可能通過增加心房Smad-2蛋白的磷酸化，進而激活TGF-β1/Smad信號通路，是后續(xù)研究需補充完善之處。

本研究還發(fā)現(xiàn)，16周大強度運動后，大鼠心房Smad-4的基因和蛋白表達顯著增加。有研究報道，力竭運動后，大鼠肝臟Smad-4的表達增加，可能介導(dǎo)了過度運動導(dǎo)致的肝損傷過程[5]。TGF-β1可通過與細胞膜受體結(jié)合，使Smad-2和Smad-3發(fā)生磷酸化，并與Smad-4結(jié)合成復(fù)合體，進入細胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。本研究中，上調(diào)的Smad-4信號通路蛋白可能介導(dǎo)了由于TGF-β1增加導(dǎo)致的纖維化反應(yīng)，在運動性心房損傷和纖維化的發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用。在損傷纖維化的不同階段，Smad-4的表達不同，可能和致病因素的持續(xù)時間和強度有關(guān)[30]。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著大強度運動時間的持續(xù)，Smad-4的表達逐漸增加，在16周時出現(xiàn)了明顯升高，這可能是造成心房發(fā)生纖維化的分子機制。與本研究結(jié)果一致，Goldstein等[15]發(fā)現(xiàn)，骨骼肌和心肌損傷后， Smad-4的表達增加，介導(dǎo)了TGF-β1促纖維化反應(yīng)。而通過體內(nèi)抑制Smad-4的表達后，纖維化程度降低，心肌和骨骼肌功能得到改善。李宏云等[4]發(fā)現(xiàn)，急性鈍挫損傷后心肌發(fā)生纖維化，Smad-4的表達顯著增加，而通過Smad-4基因沉默后，骨骼肌纖維化程度明顯降低，減輕了瘢痕形成。研究證實，Smad-4在心肌細胞肥大到凋亡的轉(zhuǎn)化過程中具有“分子開關(guān)”的作用。Smad-4的過表達增加了細胞凋亡蛋白酶caspase 3的表達，增加了bax/bcl-2的比例，介導(dǎo)了心肌肥大的發(fā)生，也促進了心肌細胞的凋亡進程[17]。早年研究顯示，大強度運動和過度運動誘導(dǎo)心肌發(fā)生凋亡，可能參與了運動性心肌的重塑過程[3]。而運動性心肌細胞凋亡的發(fā)生是否和Smad-4的表達增加有關(guān)，需要進一步的研究予以證實。

Smad-7是TGF-β1/Smad信號通路中的抑制性調(diào)控分子，其可與TGF-β1的I型受體競爭性結(jié)合，阻止R-Smads的磷酸化，從而阻斷TGF-β1的效應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，12周和16周大強度運動顯著降低了心房Smad-7的表達。Smad-7和Smad-2之間的平衡被打破，造成Smad-2和Smad-4復(fù)合物核轉(zhuǎn)位增加，纖維化因子轉(zhuǎn)錄增加。TGF-β1可通過下游Smad信號通路，激活膠原蛋白的合成途徑，使成纖維化細胞增殖，細胞外基質(zhì)的增加，誘發(fā)心房纖維化[20,35]。TGF-β1表達增加和Smad-7表達減少，促進了纖維化的發(fā)生[39]。而Smad-7高表達，可消除由TGF-β1所誘導(dǎo)的Smad-2的磷酸化，降低了α-SMA和CTGF等纖維化因子的表達，阻止了成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，使膠原蛋白的含量降低[31]。另外，Smad-7的降低可能使抵抗活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的作用降低。敲除Smad-7基因誘導(dǎo)心肌ROS升高，ROS可增加MMP-9的活性，成纖維化細胞膠原蛋白合成增加。相反，Smad-7的過表達可通過降低心肌成纖維細胞ROS的產(chǎn)生，通過抑制MMP-9活性，降低膠原蛋白增加，抑制纖維化的發(fā)生[36]。急性或大強度耐力運動誘導(dǎo)心肌中的ROS含量增加，已經(jīng)被研究證實[13,22]，但其是否和Smad-7的表達降低有關(guān)，需進一步研究予以證實。

研究顯示，Smad-7的表達受miR-21的調(diào)控[16,23,24]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過結(jié)合在Smad-7的3'-UTR端，抑制其轉(zhuǎn)錄水平。TGF-β1干預(yù)原代培養(yǎng)的成纖維細胞，成熟miR-21的表達增加，而Smad-7蛋白水平降低。敲除miR-21或Smad-7過表達均能阻遏TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化發(fā)生，而miR-21的過表達或抑制Smad-7則促進了纖維化發(fā)生[23]。miR-21的過表達抑制了Smad-7蛋白轉(zhuǎn)錄，而膠原蛋白的含量增加，加強了TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化程度[33]。Li等[24]證實，具有冠狀動脈疾病的患者血液中，miR-21和TGF-β1的含量增加，而Smad-7的表達降低。上調(diào)miR-21降低了Smad-7的表達，下調(diào)miR-21則增加了Smad-7的表達。血管緊張素II可誘導(dǎo)miR-21表達，靶基因PTEN的表達降低，導(dǎo)致Smad-7的表達降低，成纖維細胞的增加，造成心肌纖維化[26]。He等[16]通過快速心房起搏建立心房纖顫模型，研究發(fā)現(xiàn)，心房TGF-β1和miR-21呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，而Smad-7的表達顯著降低。體外用TGF-β1干預(yù)成年大鼠心肌成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)miR-21表達增加，而Smad-7表達降低，TGF-β1抑制劑則降低了miR-21的上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21前體抑制了Smad-7，而miR-21抑制劑則促進了Smad-7的表達，提示，Smad-7可能是miR-21的作用靶基因。本研究前期結(jié)果表明，長期大強度運動導(dǎo)致大鼠心房miR-21呈現(xiàn)持續(xù)高表達，其可能是通過下調(diào)Smad-7的表達，促進心房損傷和纖維化的發(fā)生和發(fā)展[8]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與安靜對照組相比，8周大強度組Smad-7表達無明顯差異，而12周和16周大強度組 Smad-7的表達顯著降低。大強度組之間進行比較發(fā)現(xiàn)，Smad-7的表達逐漸降低。與此一致，有研究表明，長期的促纖維化因子作用于心肌，Smad-7的表達隨時間呈現(xiàn)下調(diào)趨勢[1,32,34]。曹輝[1]研究顯示，神經(jīng)卡壓造成的骨骼肌損傷纖維化過程中，Smad-7的表達隨卡壓時間的延長表達呈逐漸下降趨勢。Wang等[32]研究也表明，心肌梗死后2周，大鼠心肌梗死區(qū)Smad-7的表達降低。而隨著梗死時間的延長，Smad-7的表達逐漸降低，8周后梗死區(qū)和梗死邊緣均發(fā)現(xiàn)Smad-7的表達降低。研究提示，在心肌纖維化發(fā)生過程中，Smad-7的表達呈現(xiàn)出進行性的降低，因此，Smad-7的表達水平和纖維化的程度呈負相關(guān)。

綜上所述，長期大強度運動大鼠心房Smad-4的表達持續(xù)上調(diào)，而Smad-7的表達進行性降低，各型Smad之間表達失調(diào)，可能是運動性心房纖維化發(fā)生的分子病理機制。這為深入了解運動性心房纖顫的發(fā)生機制提供了實驗依據(jù)。

4 結(jié)論

長期大強度運動導(dǎo)致大鼠心房Smad-4的表達持續(xù)上調(diào)，而Smad-7的表達進行性降低，各型Smad之間表達失調(diào)，這可能是運動性心房損傷和纖維化發(fā)生的分子病理機制。

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Expression of Smad Gene and Protein in the Development of Exercise-induced Atrial Damage and Fibrosis

WANG Shi-qiang1,2，CHANG Yun2，RAO Zhi-jian2，MA Xiao-wen2

Objectives:This study was carried out to determine the expression of smad gene and protein in the development of exercise-induced atrial fibrosis.Methods:48 adult male sprague-dawley rats,8-week old,were randomly divided into two groups:Control group(C),and Highly intensive exercise group(H).Then each group is divided into 8 weeks,12 weeks and 16 weeks group.Group H were trained for 8 weeks,12 weeks and 16 weeks of treadmill exercise respectively.mRNA and protein expression of Smad-2,Smad-4 and Smad-7 were detected by Real time PCR and Western Blot.Results:Smad-2 expression of H group has a trend of increase,but there was no significant difference,compared to control group.mRNA and protein expression of Smad-4 increased significantly after 16 week-highly-intensive exercise(P<0.05,P<0.01).Smad-4 mRNA expression increased with the extension of time,thus the Smad-4 mRNA expression of H group after 16 weeks is significantly higher than 8 weeks(P<0.05).Aftre 16 week-highly-intensive exercise,mRNA and protein expression of Smad-7 significantly decreased(P<0.05).Smad-7 mRNA and protein expression gradually reduced after 12 and 16 weeks of highly intensive exercise(P<0.05).With the extension of time,Smad-7 mRNA expression reduced gradually.Thus the Smad-4 mRNA expression of H group after 16 weeks is significantly lower than 8 weeks(P<0.01).Conclusion:Long-term highly intensive exercise caused the expression of atrial Smad-4 increase,while progressive decrease of the Smad-7,inducing disorders between Smad,Which may be the molecular pathological mechanism of exercise-induced atrial fibrosis.

highlyintensiveexercise;atrial;fibrosis;Smad;atrialfibrillation

1000-677X(2016)11-0050-06

10.16469/j.css.201611006

2016-06-28；

2016-10-28

國家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(15-37)。

王世強(1987-)，男，山東濟寧人，講師，博士，主要研究方向為運動心臟生理和病理，E-mail：suswsq@163.com；常蕓(1957-)，女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，研究員，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為運動員心臟病生理與醫(yī)務(wù)監(jiān)督，Tel：(010)87182526，E-mai：changyun@ciss.cn；饒志堅(1989-)，男，江西上饒人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心臟生理和病理。

1.湖南工業(yè)大學(xué) 體育學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.國家體育總局體育科學(xué)研究所，北京 100061 1.Hunan University of Technology，Zhuzhou 412000，China；2.China Institute of Sports Science，Beijing 100061，China.

G804.5

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