馬雪濤，譚建林，牛之瑞，馮雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南昆明650223）

分子印跡柱凈化-UPLC-MS/MS測定果蔬制品中展青霉素

馬雪濤，譚建林*，牛之瑞，馮雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，云南昆明650223）

建立分子印跡親和柱凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測果蔬制品中展青霉素的方法。樣品經(jīng)2.5%乙酸水提取，分子印跡親和柱凈化，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定，外標法定量。展青霉素在2.0 ng/mL～50.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好（R2≥0.999 8），方法的檢出限為2.0μg/L。在添加水平為5.0和50.0μg/L時，4種果蔬制品回收率為78.4%～92.0%，相對標準偏差低于7.2%。該方法準確、穩(wěn)定、靈敏，能夠滿足果蔬制品中展青霉素檢測與確證的需要。

分子印跡親和柱；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；展青霉素；果蔬制品

展青霉素（4羥基-4H-呋[3，2c]吡喃2（6H）-酮），主要是青霉屬、曲霉屬和Byssochlamys菌種產(chǎn)生的一種真菌毒素，主要存在于蘋果、梨、葡萄等多種水果及其制品中，是影響水果及果汁飲料品質(zhì)的主要因素之一[1]。展青霉素通過巰基的強親和力抑制多種酶的活性[2]，主要是含有-SH基的酶，如乳酸脫氫酶、磷酸果糖激酶、Na+-K+ATP酶等。此外，它能夠擾亂線粒體和質(zhì)膜的功能[3]。展青霉素對免疫系統(tǒng)有不同程度的抑制作用，可以明顯地抑制腹膜巨噬細胞的化學熒光反應(yīng)，降低淋巴細胞，特別是B細胞的數(shù)量[4]。展青霉素對人類的急性毒理反應(yīng)包括惡心，嘔吐和其他胃腸道創(chuàng)傷，慢性接觸展青霉素被證明能夠誘導腫瘤細胞的形成，引起基因突變，胚胎發(fā)育缺陷[5-6]，它也能誘導白血病的產(chǎn)生[7]。展青霉素檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）[8-9]、高效液相色譜法（HPLC-UV/DAD）[10-12]、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[13-14]、串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[15-17]。這些方法能夠快速的對展青霉素進行檢測，也能達到令人滿意的檢出限。這些方法中HPLC方法是目前使用最廣泛的分析水果及其制品中展青霉素的方法，但必須注意的是HPLC-UV/DAD分析果汁樣品時可能會出現(xiàn)干擾峰[11]，從而影響結(jié)果的判斷，而一般的氣相色譜法則要求衍[18]，所需要的時間較長。

分子印跡親和柱的固定相是三維交聯(lián)的高分子聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以很好的識別目標分子結(jié)構(gòu)及功能團位置，模擬抗原抗體的高度選擇性。展青霉素分子印跡親和柱可選擇性吸附樣品中的展青霉素，從而對樣品起到非常針對性的凈化和富集作用，將樣品中待測物濃縮。分子印跡親和柱與UPLC-MS/MS配合使用可到達快速測定的目的，以改善信噪比，提高檢測方法的準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-30A超高效液相色譜儀：日本島津公司；API 3200 MS/MS三重四極桿質(zhì)譜儀：美國AB公司；E12140電子天平：美國OUAUS公司；微型氮吹儀：上海精密儀器公司；SB25-12型超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；色譜柱：SHIMADUODS III（1.7μm，50mm×2.0mm，日本島津）、Phenomenon XDC18（1.7μm，75mm×2.1mm，美國菲羅門）、Waters UPLCBEH Phenyl column（1.7μm，50mm×2.1mm，美國Waters）、展青霉素分子印跡親和柱和228多功能凈化柱（北京泰樂祺科技有限公司）、HLB柱（美國菲羅門）。

乙腈和甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純；展青霉素標品（純度為98%）：百靈威科技有限公司；果膠酶（酶活力≥1 400U/g）：Sigma公司；果蔬制品為本地市場采購。

1.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：柱溫40℃；流動相：A水、B乙腈；流速：0.4mL/min；進樣量：10μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab le1 Gradientelution program

質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧離子化負離子模式（ESI-）；電噴霧電壓（IS）：5 500 V，霧化氣壓力（GS1）：4.13 Pa，氣簾氣壓力（CUR）：1.38 Pa，輔助氣流速（GS2）：4.13Pa；離子源溫度（TEM）：650℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），檢測離子對及碰撞能量：定量離子對，m/z152.9>108.9（-13 U/eV），定性離子對，m/z 152.9>81.0（-18U/eV）。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取展青霉素標準品10mg于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成1.0mg/mL展青霉素標準儲備液。于-4℃下避光保存。準確量取適量展青霉素標準儲備溶液，用0.1%乙酸水溶液逐級稀釋該標準溶液，配制2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品處理

取20mL樣品，加入150μL果膠酶，混合均勻后放置過夜，于5000 r/min離心5min，準確移取超2.5mL上清液并加入2.5mL 2%乙酸水溶液，混勻后過分子印跡親和柱凈化（凈化前先后上2mL乙腈和1mL水平衡分子印跡親和柱），取1mL1%NaHCO3水溶液清洗柱子，再立即加入2mL水清洗，加壓將柱體內(nèi)的水排干。加入1mL乙醚洗滌，然后加入4mL乙酸乙酯洗脫，隨后在洗脫液中加10μL純乙酸以防止展青霉素降解。將洗脫液用氮氣吹至近干，立即加入1mL 0.1%乙酸水溶液溶解，漩渦1min后過0.22μm濾膜待UPLC-MS/MS分析測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 展青霉素質(zhì)譜信號優(yōu)化

目前對真菌毒素的質(zhì)譜檢測方法中，大多采用電噴霧離子源（ESI），對于展青霉素來說，大氣壓化學電離源（APCI）所獲得的質(zhì)譜信號比ESI弱。在ESI負離子模式下，展青霉素的質(zhì)譜信號也比ESI正離子模式強[19-20]。采用展青霉素的10μg/mL標準溶液以流動注射的方式在ESI負離子模式下，確定其分子離子，以其分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，選取兩個豐度較強、干擾較小的子離子，最后在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）負離子模式下優(yōu)化其質(zhì)譜參數(shù)。

本試驗考察了10種流動相（見表2）和3種色譜

柱（柱A：SHIMADUODS III；柱B：Phenomenon XDC18；柱C：WatersUPLCBEH Phenyl column）對展青霉素電離效率的影響，結(jié)果見圖1。

表2 電離效率試驗中10種流動相Table2 10 kindsofmobilephase in theexperimentof ionization efficiency

圖1 不同流動相和色譜柱對展青霉素質(zhì)譜信號的影響Fig.1 Effectofdifferentm obilephasesand chrom atographic columnson the developmentof patulinmassspectrometry

從圖1可以看出，在水相中加入乙酸銨和碳酸氫銨會降低展青霉素的電離效率，所以本次試驗選擇水和甲醇作為流動相，色譜柱為SHIMADUODSIII。

2.2 假陽性現(xiàn)象

固相萃取技術(shù)（SPE）是一種常用的水果及其制品中展青霉素的提取和凈化方法，使用較為普遍的是HLB柱和228多功能凈化柱。HLB屬于反相吸附柱，對極性化合物和非極性化合物都有較好的保留，在食品分析前處理中較為常見；而228多功能凈化柱（MFC）則是一種特殊的SPE柱，以極性、非極性及離子交換等組成填充劑，可選擇性吸附樣液中的脂類、蛋白類等雜質(zhì)，展青霉素不被吸附而直接通過。HLB柱和228多功能凈化柱在使用中都有一個共同的缺點，即它們都只能除去大分子物質(zhì)和展青霉素極性相差較大的雜質(zhì)，對于與展青霉素極性相似或結(jié)構(gòu)相似的化合物，則不能達到除雜的效果。分別使用HLB、多功能凈化柱、分子印跡親和柱對水果及其制品中的展青霉素進行凈化比較分析中發(fā)現(xiàn)，3種固相萃取柱在處理蘋果汁、梨汁、葡萄汁等色素含量少的樣品時，都能達到良好的凈化效果。但是在處理色素較多的樣品時，例如紫薯，HLB和多功能凈化柱處理后的樣品中都存在假陽性現(xiàn)象（定量離子對和定性離子對都出峰，但是豐度比與展青霉素標準物質(zhì)相差較大），而分子印跡親和柱則能很好的去除紫薯干擾，如圖2所示。

圖2 比較分析3種固相萃取柱對紫薯凈化效果Fig.2 Analysisand comparison of three kindsof solid phaseextraction colum n for purification of purplesweet potato

2.3 方法評價

對2.0 ng/mL～50.0 ng/mL的展青霉素標準溶液進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，相應(yīng)峰面積為縱坐標，線性回歸方程為Y=472X-1360；相關(guān)系數(shù)R2≥0.9998。結(jié)果表明，在此濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好。

方法檢出限是依據(jù)1.4操作步驟進行添加回收，根據(jù)3倍信噪比確定該方法的檢出限2.0μg/L，10倍信噪比確定該方法的定量限5.0μg/L。

選取陰性的典型樣品，向試樣中添加展青霉素的標準溶液，分別進行5.0μg/L和50.0μg/L的加標回收試驗，每份樣品檢測6次，采用基質(zhì)標準品進行定量和回收率計算。試驗結(jié)果表明本方法的回收率為78.4%～92.0%，相對標準偏差小于7.2%。空白試樣的添加濃

度和回收率的試驗數(shù)據(jù)見表3。

表3 展青霉素的回收率和回收率Table3 Recovery and precision（RSD）of patulin

3 結(jié)論

從云南本地市場采購的水果及其制品樣本，應(yīng)用本方法對蘋果汁、梨汁、葡萄汁、紫薯汁等不同種類的果蔬制品共計18個樣品進行分析測定，均未檢出展青霉素。本試驗采用分子印跡親和固相萃取技術(shù)進行樣品前處理，建立了果蔬制品中展青霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法能夠很好的排除復雜樣品中的假陽性現(xiàn)象，提高檢測的準確性，方法的檢出限、準確度、精密度、穩(wěn)定性和線性關(guān)系均滿足展青霉素的分析檢測要求。

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Determ ination of Patulin in Fruit and Vegetable Products by UPLC-MS/MSCoupled w ith M olecular Im printing Colum n

MA Xue-tao，TAN Jian-lin*，NIU Zhi-rui，F(xiàn)ENG Lei
（Yunnan Instituteof ProductQuality Supervision and Inspection，Kunming650223，Yunnan，China）

Amolecular imprinting affinity column coupled with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometric（UPLC-MS/MS）method for the determination of patulin in fruitand vegetable products.Sampleswere extracted 2.5%acetic acid water.The crude extractwas purified onmolecular imprinting affinity column.Sample determined and confirmed by UPLC-MS/MS.Patulin chosen showed good linearity the rangeof2.0 ng/mL-50.0 ng/mL（R2≥0.999 8）.The limitofdetection（LOD）was2.0μg/L.The averge recoveries of patulin in four kinds of fruit and vegetable products at spiked levels of 5.0 and 50.0μg/L ranged from 78.4%to92.0%with relative standard deviations（RSDs）smaller than 7.2%.Themethod isaccurate，stable，sensitiveand suitable for thedetermination ofpatulin in fruitand vegetable products.

molecular imprintingaffinity column；UPLC-ESI-MS/MS；patulin；fruitand vegetable products

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.031

2015-10-08

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2013zjjz308）

馬雪濤（1974—），女（回），副高級工程師，碩士，研究方向：食品中非法添加劑的檢測。

*通信作者：譚建林（1985—），男（漢），碩士。